用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可显出各层析斑点。 （五）计算
计算各种氨基酸的Rf值。 【要点提示】
1.取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。
2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，并且样品用量大会造成“拖尾巴”现象。
3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 【思考题】
1.纸层析法的原理是什么？
2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 【参考文献】
1. 王秀奇 等．基础生物化学实验(第二版)．高等教育出版社．1999 2. Blocd R.J.A., Manual of paper chromatograhy and paper electrophoresis. 1956
实验二 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量
【实验目的】
1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法 2.熟练分光光度计的使用和操作方法 【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。在一定蛋白质浓度范围内（1～1000μg/ml），蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与
25
蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。由于染色法简单迅速，抗干扰性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的蛋白质快速微量测定方法。 【器材与试剂】 （一）器材
1.可见光分光光度计 2.刻度移液管 3.移液枪
4.新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等 （二）试剂
1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂
称取考马斯亮蓝G250 100mg，加95％乙醇50ml，溶解后加入85％H3PO4（W/V）100ml，加水稀释至1000ml，保存于棕色瓶中。 3. 蛋白质标准液
准确称取凯氏定量法校正的结晶牛血清蛋白，配制1000μg /ml的标准溶液。
【实验步骤】 （一）标准曲线的制作
取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。
试 剂
1
1000μg/ml标准蛋白溶液（ml）
0.9%生理盐水（ml） 蛋白质含量（μg/0.1ml）
26
试管编号
2 0.2 0.8 20
3 0.4 0.6 40
4 0.6 0.4 60
5 0.8 0.2 80
6 1.0 0 100
0 1.0 0
另取试管6支，准确吸取所配各管蛋白质溶液0.1ml，然后加入5.0ml考马斯亮蓝G250试剂，充分振荡混合，放置5min后，于595nm测定光吸收值（以1号试管为空白对照）。以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品提取液中蛋白质含量的测定
准确称取小麦叶片（或绿豆芽下胚轴）约200mg，加入蒸馏水5ml，于研钵中研成匀浆，转移至离心管中，4000rpm离心10min，将上清液倒入10ml容量瓶中，残渣以2.0ml蒸馏水悬浮后，4000rpm再离心10min，合并上清液，定容至刻度。
取3支试管，各吸取上述样品提取液0.1ml，分别加入考马斯亮蓝G250试剂5.0ml，充分振荡混合，放置5min后，以制作标准曲线的1号试管为空白对照，于595nm测定光吸收值。根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，取3个重复样品中蛋白含量的平均值。 （三）结果计算
样品蛋白质含量（μg/g鲜重）＝a (μg) × 提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）]
式中 a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为μg。 （四）标准比较法（或称标准管法）测定样品提取液中蛋白质的含量
取试管3支，按下表操作。
试管编号
试剂
待测管（U）
样品提取液（ml） 标准蛋白溶液（ml） 0.9%生理盐水（ml） 考马斯亮蓝试剂（ml）
0.1 － － 5.0
放置5min
A595
样品提取液蛋白质含量a（μg）＝（Au/As）×100
样品蛋白质含量（μg/g鲜重）的计算方法同“（三）结果计算”。
调零
标准管（S）
－ 0.1 － 5.0
对照管（B）
－ － 0.1 5.0
27
【要点提示】
1.研究表明，NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)2SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如Triton X-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量颜色干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min～1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。
2.测定那些与标准蛋白质氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
3.待测液中蛋白质浓度不可太高，应控制在100～800μg/ml为宜。否则，应用生理盐水稀释。 【思考题】
1. Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？
2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？ 【参考文献】
1. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976,72: 248～254
2. 李建武 等．生物化学实验原理合方法．北京大学出版社．1994 3. 王宪泽．生物化学实验技术原理和方法.中国农业大学出版社．2002 4. 张龙翔 等．生化实验方法和技术（第二版）.高等教育出版社.1997
实验三 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白
【实验目的】 1.学习区带电泳的原理
2.掌握乙酸纤维素薄膜电泳操作技术 【实验原理】
带有电荷的颗粒在电场中向其电荷相反方向的电极移动，称为电泳
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（electrophoresis）。带电颗粒在电场中的移动方向和迁移速度取决于颗粒自身所带电荷的性质、电场强度、溶液的pH值等因素。
蛋白质分子是两性电解质，在溶液中可解离的基团除了末端的α-氨基和α-羧基外，还有侧链上的许多基团。由于解离基团的差异，不同的蛋白质具有不同的等电点。当溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。
一个混合的蛋白质样品，由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH值溶液中其带电性质、电荷的数目各不同，再加上它们的分子颗粒大小、形状不一，因此在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。
目前应用最广泛的电泳方法是区带电泳。乙酸纤维素薄膜电泳是以乙酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。乙酸纤维素（二乙基纤维素）薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它作为区带电泳的支持物，具有样品用量少、图谱清晰、电泳时间短（约45～60min）、灵敏度高（5μg/ml蛋白质即可检出）、可准确定量等优点，在各种生物分子的分离、临床检验及免疫电泳等方面已得到广泛使用。
人血清中含有数种蛋白质，其等电点（pI）大都在8.6以下，将样品点在薄膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，因为各蛋白质都带有负电荷，在电场中都向正极移动。电泳后，用氨基黑10B溶液染色，经脱色液处理除去背景染料，可得到背景无色的各蛋白质电泳图谱。由正极到负极依次为：白蛋白、α1-球蛋白、 α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。各蛋白含量可用光密度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定。 【器材与试剂】 （一）器材
1.电泳仪 2.电泳槽
3.微量注射器或微量吸管 4.载玻片（厚约1mm） 5.滤纸
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