6.5%~20%的丙烯酰胺凝胶液在6种不同比例的双丙烯酰胺存在时聚合后的孔径大小。孔径的大小很大程度上取决于两者的总浓度(T)。T值增大，孔径相应变小，机械强度增强。值得注意的是当T值不变时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%孔径却相应变大，因此就可能有这样的现象出现：当Bis浓度在5%以上或以下时，尽管T值很大，但却比T值小而Bis为5%时的孔径要大。 分离蛋白质的实践证明，胶的孔径大约是蛋白质分子平均大小的一半时分析结果较好。例如，肌红蛋白和细胞色素分子的半径为2nm，那么可选择平均胶孔半径为1nm的凝胶度。因此，在实用中常按样品的相对分子质量(Mr)大小来选择适宜的凝胶孔径,如下表。
不同相对分子质量（Mr）范围所选用的凝胶浓度百分率
物质 蛋白质 相对分子质量 ＜104 1~4×104 4×104~1×105 1~5×105 ＞5×105 核酸（RNA） ＜104 104~105 105~2×106 适用的凝胶浓度% 20~30 15~20 10~15 5~10 2~5 15~20 5~10 2~2.6 常用的所谓标准胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。
3、缓冲系统的选择 在选择缓冲系统时主要从以下两方面来考虑： （1）、pH范围、离子种类和离子强度 对蛋白质来说，选择pH值应能使样品中各种蛋白质分子泳动率的差别最大。酸性蛋白质在高pH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下常得到较好的分离效果。如果蛋白质样品经电泳分离后，还希望测定其生物活性，则缓冲系统的pH值不应过大或过小（大于pH9左右或小于pH4），否则会引起蛋白质活性的钝化。目前常用的分离胶缓冲系统有高pH（pH9左右）、低pH（Ph4左右）和中性三大类。此外，通常选用离子强度较低的缓冲溶液（0.01~0.1mol/L）。因为离子强度低，电泳分离过程短，产生的热量也较小,
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分离效果好。
（2）、连续和不连续系统 所谓连续系统是指电泳槽中的缓冲系统和pH值与凝胶中的相同，不连续系统是槽中与凝胶中的缓冲系统的分辨率较高。 4、不连续盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续盘状电泳往往包含两种以上的缓冲溶液，pH和凝胶孔径。多用于分析浓度较稀的样品。一般是在内径为0.7cm,长10cm的小玻璃管内，把3种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。包括①样品胶(其中含有样品)；②浓缩胶(又名成层胶)，这两种胶的缓冲液，pH和孔径大小完全一样，③分离胶(又称电泳胶)，其孔径一般比浓缩胶小，pH值也不同；样品胶和浓缩胶是T=3%,C=20%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液中由核黄素催化合成的大孔胶,Ph6.7.而分离胶是由T=7%,C=2.5%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液(pH8.9)中通过过硫酸铵催化聚合成的小孔胶。将含有这3种凝胶的玻璃管放在含有Tris-甘氨酸(pH8.3)缓冲液的电泳槽内进行电泳，就是不连续的盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。它之所以有很高的分辨率是因为有3种效应：即浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中中被压挤成层呢？这是因为样品胶和浓缩胶是用pH6.7的Tris-HCI缓冲液制成；电泳时,由于HCI解离度大,几乎全部释放出CI离子，而在电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液是pH8.3,因为甘氨酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子(1%~0.1%)解离成H2N-CH-COO离子。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子,但其解离度比HCI小，比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷,在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即:mCLaCL>m蛋a蛋〉m甘a甘。 m为泳动率；a为解离度；ma为有效泳动率。
根据有效泳动率的大小，最大称为快离子(或先行离子，这里是CI离子)，最小的称为慢离子(或随后离子,这里是H2N-CH-COO离子)。电泳开始时3种凝胶中都含有快离子,只有电泳槽中的缓冲液含有慢离子。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大,在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度是成的比的: E=（I/η）（V/cm）
E为电势梯度；I为电流密度；n为电导率。
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所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区和代电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、快离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。 电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状蛋白质区带。
分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于pH和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的pH为8.9,电泳时经实际测量为pH9.5）,使甘氨酸的解离度增大,因而它的有效泳动率也增加,此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量(Mr)或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛效应在分离胶中被分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳除具有分子筛作用以外,还具有下面一些优点: (1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的凝胶，可以通过调节控制单体浓度或单体和交联剂的比例，形成不同程度的交联结构，很容易得到孔径大小，范围广泛的凝胶，所以实验重复性很高。
(2)聚丙烯酰胺形成的凝胶，机械强度好，弹性大，便于电泳后的一切处理。 (3)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳的多聚体，只带有不活泼的酰胺基侧链，没有其他离子基团，因而几乎没有电渗作用。并且不与样品相互作用。
(4)在一定范围内，聚丙烯酰胺对热是稳定的，凝胶无色透明，易于观察，可用检测仪直接测定。
(5)设备简单，所需样品量小(1~100ug),而分辨率高.在超微量分析中,能检出含量在10-9~10-12g的样品。
(6)用途广泛,对生物高分子化合物(如蛋白质、酶、核酸)能进行分离鉴定。又可用于毫克水平的制备。
目前广泛应用于分子生物学、生物化学、细胞学、微生物学、植物学、动物学、免疫学等学科的研究以及临床化验。
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第二部分 学 生 实 验
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
【实验目的】
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】
纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材
1.层析缸 2.点样毛细管 3.小烧杯
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4.培养皿 5.量筒 6.喷雾器
7.吹风机（或烘箱） 8.层析滤纸（新华一号） 9.直尺及铅笔 (二) 试剂
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 2. 氨基酸溶液
0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。 3. 显色剂
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】 （一）准备滤纸
取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。 （二）点样
用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2～3次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 （三）扩展
用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升15～20㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 （四）显色
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