透析袋

生 物 化 学 实 验 指 导

第一部分 常用生物化学实验技术及原理

第一章 透 析(Dialysis)

透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影响。下面就粗略地讨论这些因素。 一、膜

1、材料 火棉胶是最常用的透析袋材料。各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。也可用玻璃纸代替火棉胶。

2、制备 先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。然后，用蒸馏水洗涤透析管。结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。

3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。 二、溶剂

1、水溶液 一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。

2、大分子溶液 透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。 三、物理条件

1、温度 透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。

2、压力 大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。这个过程称为超滤。 四、董南(Donnan)膜平衡

由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。

蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。

第二章 层析法(Chromatography)

层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如

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表2-1。

表2-1层析法的一般分类

固定相 固体：吸咐剂 离子交换剂 固体 液体 液体 液体 固体 液体 流动相 液体 液体 液体 液体 液体 气体 气体 操作方式 柱型 薄层 柱层 薄层 纸 柱型 柱型 名称 吸附层析 离子交换层析 吸附薄层层析 分配层析 分配薄层层析 纸层析 气体吸咐层析 气体分配层析 此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。 一、柱层析法的一般技术

1、柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。

2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低

3、装柱 层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。

4、加样 上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的

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表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。 5、洗脱 下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。 洗脱法是最常用的方法。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。 6、部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列试管中或使用部人收集器。这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。第一部分的蛋白质或核酸的含酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。 二、几种常用的层析法 （一）吸附层析

这是首次由Tswett用来分离色素的层析方法。吸附剂的经典含义可能说成是一种表面具有吸咐分子的特性的固体（特别是当它是多孔的和分得很细的时候）。如氧化铝、硅胶、活性炭等固体物质都具有吸附性能，可以将一些物质自溶液中吸附到它的表面。它和离子交换换树脂不同，吸附剂表面和分子的吸引力，理论上不含有静电力。吸附可以是非常特异的，以致于可以从一个混合物中选择性地吸附一种物质。用这种方法所以能进行各种成分的分离是由于它们被吸附剂所吸附的程度以及它们在分离用的溶剂中的溶解度有差异。当然这些特点是由各成分的分子结构所决定的。

例如，在柱吸附层析中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃柱中进行的。混合物加到柱上，然后用一个适当的溶剂(或是混合溶剂)通过这个柱。混合

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物就随着溶剂的流动而逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物被吸附剂逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物全被吸附剂吸附在柱的上层，当继续加入溶剂时，柱中就会连续不断地发生混合物中各物质的溶解，吸附，再溶解，再吸附的反复交替过程。如被吸附的某物质被溶剂解出来（解吸作用）后就随着溶剂向下面流动，当遇到新的吸附颗粒时，又从溶剂中吸附出来，后面继续流下来的新溶液又再把它溶解出来并被带着往下移动，又再被吸附。就这样，经过一段时间之后，混合物中各物质都会从柱顶向下移动一段距离，但是由于各物质被吸附剂吸附的程度以及它们被溶剂溶解的能力不同而向下移动的距离不同因而彼此分离。吸附性弱的，就比较容易被溶剂溶出，又因为它再被吸附的力量比较弱，所以在柱中移动的距离就大些。经过适当的时间后，混合物中各物质就可以完全分开。

现在一般最常用的方法是在各组分离以后，让柱继续展开，用溶剂把被吸附的物质由吸附柱上冲洗出来，部分地收集从柱上流出的洗脱液，随后再进行分析。 对任何一种特殊的吸附剂和溶剂洗脱系统的选择由所要完成的分离来决定。在选择吸附剂时必须小心，因为有时一些吸附剂在分离时可引起某些化合物的降解。

吸附层析的操作方式在柱型和薄层两种。具体操作技术请见本章“一、柱层析法的一般技术”和“（四）薄层层析”两部分。 （二）离子交换层析

离子交换层析利用含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质来分离分离物质。

1、离子交换基质 Adams和Holnes有1935年通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不溶性树脂，制成了第一个人工合成的离子交换材料。从此以后，人工合成的离子交换树脂日见增多（多数是从芳香族化合物合成的），由苯乙烯及交联剂二乙烯苯聚合得到的物质是一种常用的树脂基质。

通过适当的反应再将可电离基团引入到芳香环上，二乙烯苯和苯乙烯的相对含量决定了聚苯乙烯链之间的交联度。交联度是指这种树脂骨架中含有二乙烯苯的重量百分率。国产树脂的交联度一般为4%~14%。树脂的交联度小时，则水溶性强，加水后树脂的膨胀性大，网状结构的网眼大，交换反应快，交换选择性低。相反，树脂的交联度大时，则水溶性弱，加水后树脂的膨胀性小，网眼小，交换

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