透析袋(3)

相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。SpladexG-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。

交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须用水充分溶胀。1g干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水值（Wr）。因为得水值不易测定，故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水性，其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。

2、凝胶柱的总体积（总床体积）Vt是干胶体积Vg，在凝胶颗粒内部的水的体积Vi及凝胶颗粒外部的水的体积Vo之和。 Vt也可从柱的直径及高度计算。

Vo也称外水体积。常常用洗脱一个已知完全被排阻的物质（如蓝葡聚糖2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。

Vi称为内部体积或内水体积，可以从凝胶干重（mg）和得水值Wr计算： Vi = mg. Wr

Vi也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬酸钾来测定，其洗脱体积等于Vi+Vo。

某一物质的洗脱体积Ve为：Ve=Vo + KdVi

Kd为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都有特定的Kd值，它与层析柱的几何形状无关。

如果分子完全被排阻，则Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以完全进入凝胶，那么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd是一个常数（0〈Kd〈1），有时Kd可能大于，则说明发生了凝胶对溶质的吸附。

溶质的洗脱特征的有关参数（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都与溶质相对分子质量（Mr）对数成线性关系，先洗脱几个已知相对分子质量（Mr）的球蛋白，用Ve/Vo对logMr对作图，然后在同样条件下洗脱未知样品，从其Ve/Vo值，在图上即可找出相对应的logMr，从而进一步算出其相对分子质量（Mr）。 不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说，在工作范围之内所得的曲线是线性的，超出工作范围曲线就不成线性。 （六）亲和层析

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亲和层析法是分离蛋白质酶等生物大分子的一种极为有效的方法。它在蛋白质分离技术中占有特殊的地位。前面讨论的各种分离方法是根据混合物中蛋白质之间的物理性质和化学性质(如蛋白质的溶解度、电荷、分子大小或疏水作用等)的差别来纯化的。这些方法的主要缺点是具有相似性质的蛋白质，由于性质差别微小而难于分离，而亲和层析是根据某种蛋白蛋对于某种配体的生物专一性。因此，如果能利用这种不同的生物专一性作为分离的基础，就会产生一种有效的纯化蛋白质的方法。早在1910年，就有人发现淀粉能吸附淀粉水解酶，在1951年，有人以“免疫吸附剂”的形式来分离抗体；1967年，Werle等人开始用胰蛋白酶的不溶酶提纯胰蛋白酶抑制剂，等等。经过几十年的研究，逐渐发展成一种新型的分离技术——亲和层析。细胞内任何一种蛋白质都有专一作用的对象。因此，从原则上讲，所有的蛋白质都能通过亲和层析来分离和纯化。与蛋白质发生亲和作用的基团称为配体（ligand）。配体是指能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子基团和分子。例如，酶的作用底物、辅酶、调节效应物、激素的受体、抗原与抗体互为配体。

1、亲和层析的基本原理 蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在一定的条件下，它们都紧密结合成复合物，如果将复合物的某一方固定在不溶性载体上，就可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。与其他方法相比，亲和层析能产生绝对的纯化作用，因此，可达到较高的纯度。采用一般的方法是提纯酶、抑制剂等生物制剂，操作十分复杂，而采用亲和层析，只需一步就能提纯百倍，甚至千倍，从而得到纯的产品，产率可达到75%~95%。

2、亲和层析的基本方法 先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功能团上。这种载体材料在其他性能方面，允许蛋白质自由通过，当含有待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合，因而被吸附在配体的载体的颗粒表面，而其他的蛋白质因对这个配体不具有特异性的结合位点，将通过柱子而流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质，可用自由配体的溶液洗脱下来，或通过改变溶液的pH、离子强度，或采用一些弱的变性试剂减弱其结合，或采用某种更强的结合物质与其竞争，使其从柱中分离出来，达到纯化的目的。

3、固相载体介质 一般用作凝胶过滤的介质，大都适用于亲和层析的介质。它们具有稳定的物理和化学性质，具有均匀、多孔的网状结构，允许大分子物质

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自由通过，流动性好，非特异性吸附少。这些固相载体首先要用化学方法进行活化，使其具备与特定的配体相结合的化学活性基团。最常用的活化方法是用溴化氰（CNBr）活化琼脂糖，目前已有商品出售。

载体中的邻位羟基和溴化氰反应形成亚氨碳酸基因。此基因通常可以和含氨基或羟基的配体反应，使配体结合在固相载体上。用溴化氰活化直接把配体结合在载体上，能使配体和载体偶联紧密，但是在生物大分子特异结合时，由于空间位阻的效应，会影响大分子结合的效率。改进的方法是在载体上连接一个臂（一般含6个碳原子），臂的未端为一活性基团，如氨基、羧基、活化的酯基等，靠这些活化的基团和配体结合在一起。如CH-Sepharose 4B带有一个6碳长的臂及活性的末端羧基；环氧活化的Sepharose6B，臂上带有一个活化的酯基；AH-Sepharose4B，其臂末端带一氨基；CDI-agarose含有N-氨基甲酸烷基酯。亲和层析的载体多为凝胶，可分成两类：一类是大孔型的凝胶，如琼脂糖凝胶其网状结构的孔径较大，容许大分子自由进出凝胶。另一类为微孔型的凝胶，如交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺基，它们是小孔径的网状结构的凝胶，使分子被排阻在凝胶颗粒之外。琼脂糖凝胶最为常见但缺点是当用变性剂溶液洗脱时易于收缩。今年来出现的，由有机亲水聚合物组成的凝胶，如乙烯聚合物，可抗压、抗酶降解，化学稳定性好，适于中等压力下进行大规模分离提纯。聚丙烯酰胺含有大量的羰酰胺基，可以作为支持物载体，其缺点是孔径太小。表面修饰的硅胶也可以作为亲和层析的介质，而且已应用于高效液相色谱中，这就是高效液相亲和层，它正成为生物工程的一种新工具。

4、配体的选择 配体是亲和层析中最重要的成分。首先，配体必须和被分离的大分子物质能形成适当亲和力的、特异的和可逆的结合。亲和力过低，大分子物质不能和配体有效结合，但过高的亲和力，需要在较强的条件下才能解析下来，而且有可能使某些被分离的大分子物质变性。所以一般要求配合和大分子物质的解离常数为5*0.001~5*0.00000001mol/L。

选择好的配体有3个原则。一是能和欲分离的生物大分子专一性结合，而且亲和力越大越好；二是结合后又能解离，而且无损于生物大分子的生物活性；三是配体上必须含有适当的化学基团，通过这些基团可以用化学方法把配体偶联到载体介质上去，而且这种偶联不损害配体与生物大分子的专一性结合。用于亲和层析的配体大体分为3类：一是对特定蛋白质具有亲和力的小分子配体，如酶的

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底物（或底物类似物）、调节配体、效应物、酶的辅助因子等；二是对特定蛋白质有亲和力的大分子，如抗体、伴刀豆球蛋白A、蛋白质类抑制剂、维生素或激素的结合蛋白或受体等；三是共价亲和层析中的配体，它含有能与目的蛋白质共价可逆作用部分。

小分子配体与目的蛋白质的结合专一性往往较差。如用固定化NAD纯化脱氢酶时，很多脱氢酶和其他蛋白质都能以类似的亲和力结合NAD，在缓冲液中加入共配体（coligand）和寻找最佳实验条件可增强目的蛋白质对配体的亲和力。 大分子配体有3类：一类是凝集类蛋白质，能结合蛋白质上的糖，可用于纯化糖蛋白，如伴刀豆球蛋白A、抗生物素蛋白能共价结合许多生物素的酶。蛋白质A能结合IgG分子的Fc部分，且亲和力很强；二类是抗体，使用抗体作配体的亲和层析称为免疫亲和层析；三类是对某种蛋白质有很强亲和力的蛋白质，如a-乳清蛋白，它在糖配体（N-乙酰葡萄糖胺）存在下，能与半乳糖转移酶发生强烈的亲和作用。

第三章 电泳技术(Electrophoresis)

带电质点在电场子中移动的现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、琼脂糖凝胶电电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、线丝电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

各种类型的电泳技术概括如下表3-1：

表3-1电泳技术的种类

类别 名称 型式 属自由电泳 不用支持物的电泳1、Tiselleus式微量电泳 技术 2、显微电泳 3、等电聚焦电泳 13

4、等速电泳 5、密度梯度电泳 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 包括常压、高压电泳（水平式或垂直式） 4、非凝胶支持物区带电水平式或垂直式泳支持物有：淀粉、（平板法、柱状纤维素粉、玻璃粉、法及线丝法） 硅胶、合成树脂粉末 5、凝胶支持物区带电泳 （1）淀粉凝胶 （2）聚丙烯酰胺凝胶 1）圆盘电泳 2）平板电泳 3）SDS-圆盘电泳 （3）琼脂糖凝胶电泳（4）琼脂凝胶电泳 用法 1、双向电泳 2、电泳-层析相结合技术 3、交叉电泳法 4、连续纸电泳 垂直式（柱状法） 垂直式或水平式 垂直式（测相对分子质量） 平板法或柱状法（如免疫电泳） 一、电泳技术基本原理

任何一种物质的质点，由于基本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。倒如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基因，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中分子向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。

不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。

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