透析袋(2)

慢，具有一定的选择性。

离子交换树脂适合分离小分子物质，如氨基酸，但对于大分子，如蛋白质是不适合的，因为大分子不能进入树脂紧密交联结构的内部。因此大分子可以用取代的纤维素和葡聚糖来分离，这些物质的分子是纤维状的，它们的大部分功能基团在表面。

2、可电离基团 按照离子交换树脂对阴离子或阳离子的亲合特性可以分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。例如，阳离子交换树脂交换周围介质的阳离子，也就是说，决定树脂究竟是阴离子的还是阳离子树脂的可交换离子所带的电荷，而不是基质上所带的电荷。

这两种类型又可进一步分成含有强电离基团的，如强酸型和强碱型；及弱电离基团的，如弱酸型和弱碱型。强离子交换树脂是完全电离的，并以带电形式存在（在极端pH值时例外）。弱离子交换树脂所含基团的电离程度依pH一个狭窄的pH范围有最大交换容量方能使用。一般含羟基的树脂在pH6左右有最大容量，而带有氨基的那些树脂在pH低于6时才有效。

离子交换纤维素含有取代了纤维素一OH的弱电离基团，这些基团的密度比较低，因为取代太多时就会使纤维素变得可溶。

对于分离结合较弱的大分子时，用弱电离部位密度较低的交换剂适合，而且在温和条件下容易解析。

3、离子交换平衡 典型的离子交换反应过程说明，在这里用含有氨基的阴离子交换树脂分离两个负电性离子。树脂可电离基团的浓度几乎可以达到6~10mol/L，因此有很高的交换容量。

虽然一般以为离子交换树脂的作用仅仅是通过离子交换过程来分离物质，但实际上也可能存在吸附作用和分子筛作用。

4、结合离子的洗脱 结合离子可以通过改变缓冲的pH来洗脱。例如，当pH靠近一种蛋白质分子的等电点时，这种蛋白质分子的净电荷就减少，与树脂的结合就减弱而被洗脱，别的带电的蛋白质仍然结合在柱上，这样就达到了分离的目的。另外，溶剂中的离子要与结合离子对离子交换剂的可电离基团发生竞争，溶剂中的离子浓度高时，就会取代结合离子，所以增加离子强度也可将结合离子洗脱。

pH或离子强度可以通过更换洗脱缓冲液陡然地改变，可用前面介绍的梯度方

5

法逐渐地改变。

离子与树脂的结合是一种动态平衡，其结合程度取决于树脂的性质、温度、离子强度和溶剂成分。同时还与树脂的电离度和被分离的物质有关。高价离子最容易结合而不易洗脱，所以在用一种高价离子取代结合离子时应使用稀溶液，而如果要导入一种低价离子时则需用浓溶液。

5、离子交换材料的准备 树脂和取代多糖（取代纤维素、取代葡聚糖）首先要在蒸馏水中吸胀，并去掉过细的颗粒。商品树脂，特别是阳离子交换剂会含有铁或其他重金属，可以用2~4mol/L的盐酸洗涤去除。

通过用适当的溶液洗涤可获得所需要的离子形式的离子交换材料。例如，氢型的阳离子交换树脂是先用盐酸洗涤，然后用水洗涤直至流出液呈中性为止。同样制备钠型是用氯化钠或氢氧化钠溶液洗涤树脂，再用水洗涤至中性。 装柱前的最后一步是用洗脱缓冲液平衡树脂，显然缓冲离子必须是不与树脂结合的。

6、离子交换层析的操作技术 详见本书第三篇演示实验二。 （三）分配层析

常用吸附层析分离法易溶于有机溶剂而难于水的混合物。可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离。分配层析法界于二者之间，在水和有机溶剂中都可溶的混合物用分配层析法易分离。

当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是所谓的分配系数（a）。

分配层析法实际上是一种连续抽提法。在这里，一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱或膜）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。

1、纸层分析的理论 Consden，Gordom和Martin首先用滤纸作支持物并以茚三酮为灵敏显色剂，建立了微量而简便的分离蛋白质水解液中氨基酸的方法。不久又发现除了氨基酸外，糖、核苷酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离，因而纸层析成为生物化学工作中一种常用的分离分析方法。

6

滤纸是理想的支持介质。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶剂就在水相和有机相之间进行分配，且部分溶质离开原点随有机相移动而进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。等纸干后，可用适当的显色方法使混合物中各组分在纸上的位置显示出来，物质移动的距离与溶剂移动距离之比就是Rf值。某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。 如果固定相不完全是惰性的，那么既发生分配，又有吸附作用和可能的离子交换，Rf和a的关系等式就会有例外。

2、样品的制备和点样 在研究生物材料时，做层析以前样品要脱盐（用离子交换或电渗析），过量的盐会使层析谱扩散和Rf值改变，同时还会影响辨认分离组分的化学反应。在层析前还可用超滤或葡聚糖来除掉蛋白质。然后用微量点样管将样品溶液（2~20μL）点于纸上，点的直径不超过0.3~0.5cm，如样品太稀需重复点几次时，每次点之前均应吹干，点间距离约2~3cm。

3、纸的选择 滤纸的质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。一般分析工作可采用新华1号滤纸（或Whatman1号），若有较多的样品需要在纸上分离提纯时则适合采用新华3号（或whatman3号）厚纸，可是其分辨力比1号滤纸差。

溶剂顺着纸的纹道扩展速度快，否则速度慢。

必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。 4、溶剂的选择 溶剂的选择与纸的选择一样，主要是根据经验，同时也取决于所要分析的物质。如果在溶剂A中样品物质移动离溶剂A的前沿近，那就是溶解度太大；如果在溶剂B中它们靠近原点周围，那就是溶解度不够大，因而合适的溶剂应该是A和B的适当的混合物，以使样品各组分的Rf值能在整个纸的长度上散布开，在某些分离中pH是一个重要因素，很多溶剂含有乙酸或氨以形成一个酸性或碱性的环境。

7

5、展层 虽然展层的方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，使其一边与溶剂槽接触，让溶剂扩展，整个装置扣在密闭的容器内，槽壁衬垫浸透溶剂的滤纸以保持恒定的蒸气压并且放在恒温室里，温度的波动全使溶剂走得不均匀，并改变Rf值。 展层方式有上行、下行和环行。

上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（即双向层析）。混合物先在第一种溶剂中被分离（溶剂应是挥发性的），干燥后将纸转900，再在第二种溶剂中进行层析。显色或用其他方法定位后得到的层析图谱与在相同条件下已知物的层析图谱比较就能鉴定混合物的各组分。 下行层析适用于一些Rf值接近的混合物。

因为溶剂滴离纸的底部，这就能使各组分较充分地分离。当然在这种情况下不能测定Rf值，而只能与标准参考物，如葡萄糖相比较。

6、显色 大部分化合物是无色的，可以用特殊的显色剂使其显色，配制显色剂时最好使用与水不混溶且挥发性较大的溶剂。显色剂可用喷雾器喷雾或迅速将纸在显色剂中浸渍。

如果被分离物质本身具有紫外吸收性质，可在紫外线照射下与纸的荧光背景对照显出暗的斑点。另外，有些化合物在紫外线下发出特殊的荧光。 （四）薄层层析

и3Ma?JIOB和IIIpa?бep在1938年叙述了植物萃取物在氧化铝薄层上的分离，但是直到1956年以后薄层层析才逐渐引起各方面的注意和重视。 薄层层析法是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离鉴定的目的。薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点。它操作方便，设备简单，展开时间短，一般只需几分钟到几十分钟。它灵敏度高，适用于微量样品的分析（小到0.01mg），但是加大薄层的厚度则又能分离较多（大到500mg）的样品。薄层层析还有一个优点是除了可用一般显色剂外，对某些薄层材料还可用腐蚀性显色剂，另外，还可以在支持物中加荧光染料以有助于点的鉴别。

薄层层析法分离物质的原理依所用不同支持物的性质而不同，可以是吸附层析、离子交换层析、分配层析或是凝胶过滤。

1、薄层的制作 在玻璃板上涂铺一层薄层，最简单的方法是在一根玻棒的

8

两端绕几圈胶布，用玻棒压在玻板上，把支持物向一个方向推动，即成薄层。 有时用上述方法制得薄层不太均匀，可能用有机玻璃自制一个涂铺器即能取得满意的结果。

薄层厚度小于200um时将影响Rf值，一般情况下厚度为250um比较合适。 可做薄层材料的物质很多，如硅胶、氧化铝、纤维素粉、DEAE纤维素、葡聚糖等，具体选择哪一种依所研究的问题而定。硅胶对大多数的物质分离都是适宜的。

有时在硅胶中加入煅石膏作为粘合剂，这时一旦与水调合就需快速操作。 2、展开 薄层层析的加样与纸层析基本相同。薄层的展开需在密闭的器皿中进行，溶剂必须达到饱和，可以在器皿内部贴上浸湿了溶剂的滤纸条。薄层层析的展开方式与纸层析一样，可以是上行、下行、单向或双向。

3、定位 和纸层析一样，可用适当的显色剂喷雾或根据组分的紫外线吸收或荧光来定位。在有放射性物质时用扫描来定位。 （五）凝胶层析

1、凝胶层析也称凝胶过滤法，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。 用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。

交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。

把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比

9

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库透析袋(2)在线全文阅读。