仪器分析考研辅导2012(7)

色谱柱确定后，vg和vI即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。 三、 色谱图

色谱图提供三个方面的信息：保留值－定性分析信息；峰高或峰面积－定量分析信息；区域宽度－评价分离的指标。

1．保留值 （1）调整保留时间tR′= tR ? t0 tR为保留时间tR，t0为死时间 tR′

测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0比值计算，即ū = L/ t0, ūx = L/tR (组分平均线速) 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，有时用保留体积来表示保留值。

（2）调整保留体积VR?? VR? = VR ? V0 = tR? Fo Fo为载气体积流速

（3） 相对保留值r2,1 r2,1= tR2 ? / tR1′= VR2? / VR1?

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，广泛用作定性的依据。 2 峰高（h）或峰面积（A）

3． 区域宽度

色谱峰的区域宽度用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。标准偏差?，半峰宽W1/2，峰底宽度Wb

关系：? 为0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。W1/2=2.354?，Wb= 4 ? 四 、色谱基本理论

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，它是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关, 即色谱峰的保留值的问题,它是色谱定性方法的理论基础。

但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关, 它是提高色谱柱分离效能的理论基础。

实际上，色谱分离要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为,既色谱总分离度问题, 它是选择分离操作条件的理论基础。 1．塔板理论

n与半峰宽及峰底宽的关系式为：

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?t??t?Ln??5.54?R??16?R?H?W1/2??Wb?222 neff?t???t??L??5.54?R??16?R? Heff?W1/2??Wb?neffn?k1?k2另可推出：

式中tR 与W1/2(Wb )应采用同一单位（时间或距离）。从公式可以看出，在tR 一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。在实际工作中，常用有效塔板数n有效表示柱效：

因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。

塔板理论用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同理论塔板数。 2．速率理论

1956年荷兰学者van Deemter（范第姆特）等提出了色谱过程动力学理论—速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，较好地解释了影响板高的各种因素。方程的数学简化式为 H = A + B / u + C u

式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。

（1） 涡流扩散项 A A = 2λdp

A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此 A = 0。 （2） 分子扩散项 B / u （纵向扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈―塞子‖状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，―塞子‖必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为 B = 2γ Dg

γ称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。 Dg为组分在流动相中扩散系数（cm3·s-1）, B与Dg成正比，.Dg与流动相及组分性质有关： (a) Dg反比于流动相相对分子质量的平方根，采用相对分子质量较大(氮气)的流动相，可

使B项降低；

(b) Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。控制较低的柱温.

另外流动相流速小，纵向扩散就大。为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。 （3） 传质阻力项 Cu

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。 ①气液色谱

传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项，即

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C = Cg+ C1

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为： Cg= 0.01k2 / (1 + k)2 ? dp / Dg

气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。

液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部的过程。液相传质阻力系数 C1为： C1 = 2 / 3 ? k / (1 + k)2 ? df2 / Dl

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分离。虽然提高柱温可增大D1，但会使k值减小，为了保持适当的C1值，应控制适宜的柱温。

气相色谱速率方程和液相色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计,影响柱效的主要因素是传质阻力项。 ② 液液分配色谱(略)

（4） 流动相线速度对板高的影响

根据van Deemter公式作H-u图，在对应某一流速有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；该点所对应的流速即为最佳流速。由图可看出： 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献

较低线速时，分子扩散项起主要作用；较高线速时，传质阻力项起主要作用；其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值。在高线速度时，固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素，随着速度增高，板高值越来越大，柱效急剧下降。

五、色谱分离操作条件的选择

在气相色谱中，除了要选择合适的固定液之外，还要选择分离时的最佳条件，以提高柱效能，增大分离度，满足分离的需要。 1． 载气及其线速的选择

除了从图中曲线可以看到最佳线速和最小板高,还可以通过对H = A + B / u + C u进行微分后求得.

图中曲线的最低点，塔板高度最小，柱效最高，所以该点对应的流速即为最佳流速。 最佳线速和最小板高可以通过H = A + B / u + C u进行微分后求得。

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dHHB??2?C?0u最佳?,将u最佳代人duuC 速率方程简化式后，得到H最小?A?2BC当u值较小是，分子扩散项B/u将成为影响色谱峰扩张的主要因素，此时，宜采用相对分子质量较大的载气（N2、Ar），以使组分在载气中有较小的扩散系数。另一方面，当u较大时传质项Cu将是主要控制因素。此时宜采用相对分子质量较小，具有较大扩散系数的载气（H2、He），以改善气相传质。当然，还须考虑与所用的检测器相适应。 2． 柱温的选择

柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则会造成固定液大量挥发流失。 降低柱温可使色谱柱的选择性增大，但升高柱温可以缩短分析时间，并且可以改善气相和液相的传质速率，有利于提高效能。所以，这两方面的情况均需考虑。

在实际工作中，一般根据试样的沸点选择柱温、固定液用量及载体的种类。在保证最难分离物质对能分离的前提下,尽可能对选择低柱温,对于宽沸程混合物，一般采用程序升温法进行。

3． 柱长和内径的选择

增加柱长对分离是有利的。一般填充柱的柱长以2~6m为宜。减小色谱柱的内径，一般会使柱效增加。

4. 进样时间和进样量 进样速度必须快，进样量少一些。

六、色谱基本分离方程

(1) 分离度

理论塔板数n(或n有效)是衡量的柱效指标，色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，一般用相对保留值r2,1表示两组分在给定柱子上的选择性。

分离度是评价色谱柱效和选择性的综合性指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽平均值之比，即

R?2tR?2??tR?1?Wb?1??Wb?2???

R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 (2) 色谱基本分离方程式 分离度受柱效（n）、选择因子r2,1和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，2由于它们的分配系数差别小，可合理地假设 k1 ≈k2 = k，W1≈W2 = W。由 n = 16 (t / W)

R得： 1n1?? W4tR

上式即为基本色谱分离方程式

R?neffr2，?1k?1nr2，?1?或?14r2，1?k4r2，11其中n称动力学因素, (r2,1-1 / r2,1) 称热力学因素,(k / 1+ k)称容量因素.

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r2， 221?k21柱效为：n?16R（）（） r2，?1k1 r2，221或n?16R（） effr2，1?1

? ① 分离度与柱效n的关系

由公式可以看出，具有一定相对保留值r2,1的物质对，分离度将取决于neff。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即

(R1 / R2)2 = n1 / n2 = neff1 / neff2 = L1 / L2 说明用柱子长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。

? ② 分离度与选择因子r2,1 的关系

由基本色谱方程式判断, 当r2,1 = 1时,R = 0.这时,无论怎样提高柱效也无法使两组分分离.显然, r2,1 大,选择性好.一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温,可有效增大r2,1 值.

? ③分离度与容量因子的关系

当k>10时,随容量因子增大,分离度的增长是微乎其微的。一般取k为2~5最宜。

? 分离方程式为色谱分离条件的选择提供了理论依据.一般在选择操作条件时,首先应

确定欲达到的分离度，然后利用公式进行有关计算.求得所需的塔板数和分析时间: ? 例题

已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min.不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min.峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min,计算：⑴柱的分离度；⑵柱的平均塔板数; ⑶达到1.5分离度所需的柱长度。

? 解 ： ⑴柱的分离度

R = 2（17.63 - 16.40）/（1.11 + 1.21）= 1.06 ⑵ 柱的平均塔板数

nA = 16 (16.40 /1.11)2 = 3493 nB= 16 (17.63 /1.21) 2 = 3397 n平均 = （3493 + 3397）/ 2 = 3445 ⑶ 达到1.5分离度所需的柱长度

R1 / R2 = ( L1 /L2 )1/2

L2 = L1/ (R1 / R2 ) 2 = 30.00 / (1.06 /1.5) 2 = 60.00 cm

七、气相色谱固定相

气相色谱固定相可分为液体固定相和固体固定相两类。

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