基因的分子生物学读书笔记(8)

（2）调控元件（control elements），例如操作子（operator）序列。 （3）调节子基因（Regulator gene）：编码与调控元件结合的蛋白质。（调节基因有时不在本身操纵子中编码，而存在其他的操纵子中）。 8. 乳糖操纵子（The lactose Operon）： 答：（1）乳糖操纵子的结构基因：

lacZ：编码水解乳糖的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。

lacY：编码一种叫乳糖转移酶（lactose permease）的细胞膜蛋白，将乳糖从胞外通过细胞壁运送到胞内。

lacA：编码硫代半乳糖苷转乙酰酶（thiogalactoside transacetylase），可消除同时被lacY转入的硫代半乳糖苷对细胞的毒性。

乳糖操纵子的结构基因受到共同的启动子和操纵子的控制： lacZ、lacY、lacA基因在共同启动子Plac的控制下，被转录在一条多顺反子mRNA上（polycistronic mRNA），被称为lacZYA mRNA。

lacZYA转录单元含有一个操作子位点Olac：操作子（Olac）位于启动子Plac3’端﹣5～﹢21间，与lac抑制子（repressor）结合。

（2）活化子和抑制子共同控制乳糖操纵子的表达： 活化子（activator）：代谢产物激活蛋白（Catabolite Activator Protein，CAP）或称为cAMP受体蛋白（cAMP Receptor，CRP），活化子对培养基中葡萄糖的浓度作出反应。 抑制子（repressor）：lacI基因编码乳糖操纵子的抑制子，它对培养基中乳糖的浓度作出反应。

（3）乳糖抑制子与操作子结合，阻止RNA pol与promoter的结合：

lac operator（Olac）与promoter（Plac）有部分序列重叠，所以抑制子与Olac的结合从空间上阻止了RNA pol与Plac的结合。

（4）Plac是弱启动子，CAP通过募集RNA pol到Plac激活lac转录：

CAP有2个结合位点：一个与位于启动子附近的DNA结合，另一个与RNA pol结合。

（5）lac抑制子和CAP的活性受到它们各自信号的变构调控： 别乳糖（allolactose）：别乳糖与抑制子结合，使抑制子变构失活，操纵子可以表达；别乳糖是乳糖经β-半乳糖苷酶转变而成，乳糖从而间接地灭活抑制子并使操纵子表达。 在缺乏乳糖时，lac抑制子阻止了lacZYA的转录，只有非常低的本底转录活性存在。

当乳糖存在时，本底水平的转移酶将乳糖运进细胞内，β-半乳糖苷酶将乳糖转变为别乳糖（allolactose）。别乳糖作为诱导物，与lac抑制子结合，使抑制子失活，从而操纵子得以表达。

cAMP：cAMP与活化子CAP结合，CAP变构并与DNA结合，募集RNA pol到启动子，激活操纵子的表达；但细胞中的葡萄糖降低cAMP浓度，葡萄糖从而间接地关闭CAP及启动操纵子的表达。

（6）组合调控：CAP也调控其他基因：

CAP作为调节子（regulator）可与不同的抑制子共同作用，对不同的基因进行调节，这就是组合调控（Combinatorial Control）。

CAP在E.coli中与一系列的调控蛋白一起作用于100多种基因。 （7）CAP和lac抑制子以相同的结构模体结合DNA：

蛋白质靠一种保守的二级结构螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）识别特异的DNA序列。

9. 选择性的σ因子： 答：（1）选择性的ζ因子（alternative ζ factor）：

不同的ζ因子与同一种RNA pol结合，ζ因子决定了RNA pol与启动子结合 特异性（promoter specificity）。

（2）许多细菌可产生一系列ζ因子，分别用于正常和极端生长条件下的转录调控： 热激（Heat shock）反应：

E.coli在温度达37℃以上时，表达大约17中热激特有蛋白。

ζ32是rhoH基因编码的一种选择性的ζ因子，它与RNA pol结合，识别这些热激特有蛋白的启动子，启动表达。 （3）噬菌体编码自己的ζ因子：

许多噬菌体（Bacteriophage）编码自己的ζ因子，利用宿主细菌的RNA pol，选择地识别噬菌体基因启动子并表达这些基因。 10. NtrC和MerR：变构激活： 答：（1）NtrC具有ATPase活性，利用变构作用促使开放起始复合物的形成： NtrC调控与氮代谢有关基因的表达，如glnA基因。 NtrC具有DNA结合和激活两个结构域（domain）。

只有在氮（nitrogen）浓度很低时，激酶NtrB才将NtrC磷酸化，使NtrC构象发生变化，暴露其DNA结合域并与特定启动子前序列结合，再利用ATPase活性水解ATP获取能量，将闭合的复合物转变为开放的复合物，激活转录。 （2）MerR通过扭曲启动子DNA而激活基因的转录： MerR控制抗汞酶基因merT的转录。

merT启动子﹣10与﹣35元件相隔19bp（一般是15~17bp），这种间隔既不是ζ70启动子的最适间隔，也不能使两种元件平行排列，因此RNA pol与启动子结合后也不能形成开放复合物。

当环境中无汞（mercury）时，MerR与merT启动子﹣10～﹣35间的一段DNA结合；聚合酶能与启动子，但无法起始转录。

当汞与MerR结合时，MerR构象变化，使所结合的DNA扭曲，扭曲使merT启动子﹣10～﹣35形成类似强启动子的结构，聚合酶可以起始merT的表达。 （3）变构激活：

多数活化子通过募集RNA pol到启动子位点的方式发挥作用，如CAP和选择性ζ因子。

NtrC和MerR通过变构激活（allosteric activation）的方式发挥作用：即这些转录活化子通过DNA或蛋白质的构象变化，使已经形成的闭合起始复合物转变为开放起始复合物。 没有NtrC和MerR的参与，RNA pol可与启动子结合，但形成没有活性的闭合起始复合物。

NtrC活化子是因为自身的构象变化才能暴露出DNA结合域，与DNA结合，并利用ATPase活性使闭合复合物转变为开放复合物。

MerR活化子导致DNA构象变化，从而使闭合复合物转变为开放复合物。 11. 抑制子以多种方式发挥表达调控作用：

答：通过抑制子（Repressors）结合位点与启动子重叠，阻止RNA pol与启动子的结合，如lac 抑制子。

阻止闭合起始复合物向开放的转变，抑制子结合位点位于启动子旁边，通过与启动子上的pol的互作而阻止转录的起始，如E.coli Gal抑制子。

阻止启动子逃离，噬菌体φ29 P4蛋白与PA2的相互作用。

12. araBAD操纵子： 答：（1）AraC的抗激活作用及其对araBAD操纵子的调控：

E.coli araBAD操纵子的启动子在有阿拉伯糖（arabinose）而无葡萄糖时活化，编码阿拉伯糖代谢的酶类得以表达。 无阿拉伯糖时，AraC与araO2和araI1序列结合，抑制转录；当有阿拉伯糖与AraC结合后，AraC与araI1和araI2结合，在CAP的协助下可激活操纵子的表达。 araBAD操纵子与lac操纵子非常相似。 （2）araBAD启动子常被用于表达载体：

阿拉伯糖对araBAD启动子的诱导活化非常强大，因此，araBAD启动子常被应用于表达载体（expression vector）。

将外源基因克隆在该启动子之后，当受到阿拉伯糖的诱导时，启动外源基因的高效表达。

13. 色氨酸操纵子（the tryptophan operon）： 答：（1）Trp操纵子及其调控：

Trp操纵子编码5个结构基因，用于色氨酸的生物合成。

当细胞内色氨酸浓度很低时，这些结构基因可在调控下高效表达。

表达由2个层次：1）Trp抑制子对转录起始的抑制；2）转录起始后的衰减作用（attenuation）。

（2）Trp抑制子：

①Trp抑制子被另一个操纵子trpR编码。

②Trp抑制子是2聚体蛋白，有一个中央核心（central core）和2个DNA识别头部（DNA-reading head）（2个亚基的C-末端）。

③Trp抑制子必须与色氨酸结合形成复合物后，才可与操纵子结合，所以色氨酸被称为辅抑制子（corepressor）。色氨酸通过终产物抑制（负反馈调节，negative feed-back regulation）的方式抑制了自身的表达。

④Trp抑制子降低转录起始约70倍，而Lac抑制子的抑制活性要强很多。 ⑤在Lac操纵子中乳糖作为诱导物（inducer），使抑制物失活，从而诱导操纵子的表达；Trp操纵子中色氨酸是辅抑制物，从而抑制操纵子的表达。 （3）Trp操纵子的衰减作用（attenuation）：

因为色氨酸浓度降低，抑制子不能得到辅抑制子（即色氨酸）的协助，Trp操纵子的转录得以起始（第一层次的表达调控）；随着色氨酸浓度的升高，Trp操纵子通过提前终止转录的方式抑制转录，这种调控叫衰减作用。 （4）Trp操纵子衰减作用的原理：

①细菌体内的转录和翻译是偶联的。

②Trp操纵子的前导肽含有2个连续的色氨酸残基，如果色氨酸的浓度很低，核糖体将会在这2个密码子处暂停。核糖体的暂停改变了前导RNA的二级结构，消除了此处的终止子结构，因而核糖体可将Trp操纵子成功转录完成。

③如果色氨酸浓度高，核糖体顺利通过了前导RNA中的终止子区，终止子可以形成并提前终止了RNA pol对于操纵子的继续转录。

④Trp操纵子的前导肽序列TrpL中有4个互补序列：通常1：2，3：4区配对，3：4配对形成终止子，2：3配对破坏终止子。

⑤核糖体对Trp操纵子前导肽中2个连续色氨酸残基的翻译与色氨酸的浓度有关，决定是否形成终止子，提前终止已经进行的转录。Trp浓度低时，核糖体停留在第10和11密码子处（1区），妨碍了1：2区配对，则2：3配对，终止子3：4配对不能形成，转录成

功完成。

（5）衰减作用的重要性：

①是一种典型的负反馈调控。

②通过抑制和衰减的共同作用精确调控细胞中色氨酸的浓度。

③单独的衰减作用也可以产生较强的表达调控：其他的氨基酸合成操纵子，如his和leu没有抑制子调控，完全依靠衰减作用进行表达调控。 ④是一种不需要蛋白质就可以进行的表达调控，这种调控通过RNA自身的结构变化实现。

（6）小结：

抑制子是Trp操纵子的主要开关（primary switch），根据环境中色氨酸的有无决定操纵子是否表达；衰减作用是Trp操纵子的精调开关（fine switch），根据环境中色氨酸浓度的高低来决定转录是否进行下去。 14. 核糖核酸开关：

答：核糖核酸开关（Riboswitches）：RNA元件直接作为小分子代谢物的感应器，由RNA元件（如上文提到的衰减子）调控基因的转录或翻译，是一种不需要蛋白质调节子，只通过RNA结构变化进行表达调控的机制。

核糖核酸开关的作用方式：

①核糖核酸开关通过衰减机制在转录终止水平发挥调控作用。

②核糖核酸开关通过调控RNA结构，屏蔽核糖体结合位点，从而在蛋白质翻译水平发挥调控作用。

15. 核糖体蛋白是其自身翻译的抑制子：一种负反馈抑制： 答：（1）核糖体蛋白合成所面临的挑战：

①每个核糖体由约50个不同的蛋白质组成，这些蛋白质必须以相同的速度同时合成。

②核糖体蛋白的合成速度还必须与细胞的生长速度密切联系起来。 （2）核糖体蛋白的合成策略——核糖体蛋白操纵子：

①核糖体蛋白基因形成几个操纵子（operon）来确保这些蛋白同速合成。每个操纵子由多达11个基因组成。

②RNA pol亚基α，β和β’基因也包含在核糖体蛋白操纵子中，因为这些亚基的合成速度也与细胞的生长速度密切关联。

③核糖体蛋白操纵子主要是翻译调控，而不是转录调控。

④对每个核糖体蛋白操纵子来说，一个（或2个）核糖体蛋白结合到mRNA上翻译起始序列附近，从而阻止核糖体的结合和翻译起始。

⑤这种抑制翻译的调控机制是很敏感的。核糖体组装好后剩余的极少量L4蛋白即可与操纵子mRNA结合，关闭自身及该操纵子中其他蛋白的合成。 16. λ噬菌体：

答：细菌噬菌体λ是一种感染E. coli的病毒。它一旦感染细菌，就会以两种方式繁殖：裂解（lytically）或溶原生长（lysogenically）。裂解生长需要噬菌体DNA的复制和新的外壳蛋白的合成。这些组分共同形成新的噬菌体颗粒，通过宿主细胞的裂解释放出来。溶原现象——一种选择性繁殖途径，包括噬菌体DNA整合进入细菌染色体并像细菌基因组的正常组分似的在每次细胞分裂的时候主动复制。 溶原性细菌在正常情况下非常稳定，但其体内处于静止的噬菌体[原噬菌体（prophage）]在细胞DNA遭受破坏时就会有效地转向裂解生长（因此会威胁到宿主细胞的继续生存）。这种从溶原性生长到裂解生长的转变称为溶原性诱导（lysogenic induction）

17. 基因表达的选择性模式控制裂解和溶原性生长： 答：（1）当PR和PL持续开放而PRM关闭时，就发生裂解生长。相反，溶原生长则是PR和PL关闭而PRM打开的结果。

（2）调控蛋白及其结合位点：

①cⅠ基因编码λ抑制子。λ抑制子既可以激活页可以抑制转录。

②Cro（意为抑制子和其他基因的控制，control of repressor and other thing）只抑制转录，类似于Lac抑制子。

③λ抑制子和Cro可以结合6个操作子中的任意一个，每个蛋白质以不同的亲和力识别这些位点，3个位点位于左控制区，3个位于右控制区。 ④λ抑制子与操作子位点协同结合。

⑤λ抑制子结合到OR1和OR2上关闭了从PR开始的转录。结合到OR2的λ抑制子与PM上的RNA聚合酶接触，激活cⅠ（抑制子）基因的表达。OR3在PRM内，结合在那里的Cro抑制了cⅠ的转录。

（3）溶原性诱导需要λ抑制子的蛋白水解切割：

λ抑制子变得类似于LexA，这使得λ抑制子也在RecA的作用下进行自身切割。切割反应除去了抑制子的C端结构域，因此二聚化和协同性马上不复存在。失去协同性使抑制子在这些位点（包括OL1和OL2）上解耦联；失去抑制从而促进了从PR和PL开始的转录，导致了裂解生长。

为了有效诱导，溶原性细胞中的抑制子水平必须严密调控：它激活其自身的表达，这是一例正自我调控（positive autoregulation）。

PRM被抑制子（在OR2处）激活合成更多的抑制子。但如果浓度过高时，抑制子也会结合OR3，从而抑制PRM（以类似于裂解生长中Cro结合OR3而抑制PRM的方式）。这样阻止了新的抑制子的合成，直到其浓度降到释放OR3的水平。 18. 抑制子的负自我调控需远程相互作用和大的DNA环： 答：OR1和OR2上结合的抑制子二聚体与协同结合到OL1和OL2上的抑制子二聚体相互作用，形成一个抑制子八聚体；为利于OR和OL之间的抑制子的相互作用，这些操作子之间的DNA——约3.5kb，包括cⅠ基因本身，必须形成一个环。当环形成时，OR3和OL3靠近，允许另外两个二聚体抑制子协同结合到这两个位点。

19. λcⅡ，一种控制溶原或裂解生长或感染新宿主的活化子： 答：CⅡ是一个转录活化子。它结合到启动子PRE（意为repressor establishment）上游的位点，刺激从该启动子开始cⅠ（抑制子）基因的转录。

E. Coli的生长条件控制CⅡ的稳定性并因而控制裂解/溶原的选择：CⅡ在E. coli中是一个非常稳定的蛋白质，它被一个特异的蛋白酶FtsH（HflB）降解，这个酶由hfl基因编码。

当生长良好时，FtsH活性高，CⅡ被有效破坏，抑制子不能合成，噬菌体倾向于裂解生长；在恶劣条件下则相反，FtsH活性低，CⅡ降解慢，抑制子积累，噬菌体倾向于溶原生长。

第二个CⅡ蛋白依赖的启动子PI，有一类似PRE的序列，位于噬菌体基因int之前。这一基因编码一种酶，该酶催化位点特异性重组，使λDNA整合入细菌染色体形成原噬菌体。第三个CⅡ依赖的启动子PAQ，位于基因Q的中间，其作用是延滞裂解发育从而促进溶原发育。

在无N蛋白和Q蛋白时，由这两个调控蛋白控制的转录也可以很好地起始。但是，除非调控蛋白修饰RNA聚合酶，否则在启动子下游几百到一千核苷酸处转录就会终止。N和Q蛋白因此被称为抗终止蛋白。

20. 逆回调控：RNA合成和稳定性控制相互影响并决定基因表达：

答：负责负调控的位点位于它所影响的基因的下游，同时降解是沿着基因逆向进行的，所以

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