基因的分子生物学读书笔记(6)

内含子的5’端是AU，3’端是AC（对应于DNA则为AT和AC）。 13. 外显子通过重组的方式完成改组，从而产生了编码新蛋白质的基因： 答：首先，某个特定基因的外显子和内含子的交界处经常与该基因编码蛋白质的结构域的边界相一致，即每个外显子似乎经常编码蛋白质的一个独立的折叠单位（也经常与一个独立的功能相一致）。

其次，许多基因及其所编码的蛋白质明显是在进化过程中部分地通过外显子复制和变异而产生的。

第三，有时在其他方面并不相关的基因中会发现相关的外显子，即有证据显示有些外显子确实在编码不同蛋白质的基因中被重复使用。 14. RNA编辑是改变mRNA序列的另一种方法：

答：与RNA剪接一样，RNA编辑（RNA editing）可以在RNA转录之后改变其序列，因而翻译出来的蛋白质与根据基因序列所推导出来的不同。介导RNA编辑的机制有两种：位点特异性脱氨基作用和引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除。

位点特异性脱氨基做欧诺个（deamination）的一种形式是，mRNA中某个特异选择的胞嘧啶经过脱氨基变成尿嘧啶。通常，对于一种给定的mRNA，RNA编辑只在特定的组织或细胞发生，而且是受到调控的。

其他酶促脱氨的RNA编辑例子包括腺嘌呤的脱氨基作用。这个反应由作用于RNA的腺苷脱氨酶（adenosine deaminase acting on RNA，ADAR，人类有3种）催化，产生次黄嘌呤。由于次黄嘌呤可以与胞嘧啶配对，所以这种编辑形式很容易改变mRNA编码的蛋白质序列。

在锥虫线粒体中发现了另一种截然不同的RNA编辑形式。在这种情况中，RNA转录后，在pre-mRNA的特定位置插入多个尿嘧啶（有时也可能是删除几个尿嘧啶）。多个尿嘧啶的插入使得mRNA的密码子和可读框发生了改变，从而完全改变了mRNA的“意思”。

尿嘧啶是又引导RNA（guide RNA，gRNA）插入到mRNA中去的。每种gRNA都可以分为3个区，第一区位于5’端，称为“锚”区，负责引gRNA到达它所要编辑的mRNA的目标区域；第二区用于精确定位在被编辑的序列中尿嘧啶将插入的位置；第三区位于3’端，是一段多聚尿嘧啶序列。

gRNA的“锚”区有一段序列，可以与mRNA上将要编辑区域的紧邻位置上（3’端）的一段序列形成碱基配对。随后编辑“指令”发出：gRNA的一段序列与mRNA上的被编辑区互补配对，但有几个多余的腺嘌呤。这些腺嘌呤在gRNA上的位置与将要在mRNA上插入尿嘧啶的位置正好相反。

gRNA与mRNA形成RNA-RNA双链，而在将要插入尿嘧啶的对应位置形成突出的单链环状结构。一种核酸内切酶识别并切开与环状结构相对的mRNA。编辑涉及在mRNA上打开的缺口中加入尿嘧啶，这个过程由3’端尿苷酰转移酶（TUT酶）催化。

尿嘧啶插入后，某种RNA连接酶把两段mRNA连接起来，而gRNA的编辑区则沿mRNA从3’→5’方向继续发挥作用。

15. 一旦完成加工，mRNA会包装好并从细胞核输出到细胞质用于翻译：

答：mRNA一旦全部加工完毕（加帽、去除内含子和多聚腺苷酸化）就会运出细胞核进入细胞质，然后翻译得到蛋白质产物。

典型的成熟mRNA携带着一组蛋白质，正是它们决定了mRNA被转运的命运。

成熟mRNA携带残留的SR蛋白，甚至另外一组专门结合外显子接头的蛋白质（当然只见于完成剪接的RNA）。一组蛋白（或者说是蛋白质组合）而不是任何单独一种蛋白质，决定了RNA是转运出细胞核还是留在细胞核内。

mRNA转运是通过核膜上的一种特殊结构完成的，这就是核孔复合体（nuclear pore

complex）。

一旦进入细胞质，蛋白质组分就会解离下来，并被识别后重新运回细胞核；然后再与另外的mRNA结合，重复下一次循环。

第14章 翻译

知识点：

1. 多肽链是由可读框规定的： 答：蛋白质合成的信息蕴藏在三核苷酸密码子中，每个密码子指定一个氨基酸。每条mRNA的蛋白质编码区由连续的、不交叉的、称作可读框（open-reading frame，ORF）的密码子串组成。每个ORF对应一个蛋白质，其起始和终止点都位于mRNA内部，即ORF的终止点不同于mRNA的终止点。

第一个和最后一个密码子分别称作起始密码子（start codon）和终止密码子（stop codon）。细菌中，起始密码子通常是5’-AUG-3’，但是5’-GUG-3’有时甚至5’-UUG-3’也使用。真核细胞总是使用5’-AUG-3’为起始密码子。这一密码子有两个重要的功能，第一，它指定掺入到增长的多肽链中的第一个氨基酸；第二，它确定了所有后续密码子的可读框。 2. 原核细胞mRNA具有核糖体结合位点，用以募集翻译机器：

答：要使翻译发生，mRNA必须募集核糖体。为了方便与核糖体结合，许多原核细胞的可读框在起始密码子的上游（5’端）含有一小段称为核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）的序列。这一元件也被称作SD序列（Shine-Dalgarno sequence），是以比较了多个mRNA序列后发现它的科学家的名字命名的。核糖体结合位点，典型地位于起始密码子的5’端的3~9个碱基内，与核糖体RNA组分之一的16S核糖体RNA（rRNA）的3’端的一段序列互补。

3. 真核细胞mRNA在5’和3’端被修饰，以促进翻译：

答：真核细胞的mRNA通过位于5’端的称为5’帽子（5’cap）的特殊的化学修饰来募集核糖体。一旦结合到mRNA上，核糖体沿着5’→3’的方向运行直至遇到5’-AUG-3’起始密码子，这一过程称作扫描（scanning）。

真核哺乳动物mRNA有另外两个特征利于翻译。其一是在某些mRNA中，起始密码子的第三个上游碱基为嘌呤并且第一个下游碱基为鸟嘌呤（5’-G/ANNAUGG-3’）。这一序列首先由Marilyn Kozak发现，称为Kozak序列。另一个有利于翻译的特征是3’端的poly-A尾结构。

4. tRNA是密码子和氨基酸之间的转配器：

答：蛋白质合成的核心是将核苷酸序列的信息（以密码子的形式）“翻译”成氨基酸。这是由tRNA分子完成的，它担当密码子及其所指定的氨基酸之间的转配器。tRNA分子有很多种，但每一种仅与一个特定的氨基酸结合并识别mRNA的一个或几个特定的密码子（大多数tRNA识别多于一个密码子）。首先，所有的tRNA在3’端均以5’-CCA-3’序列结束。这就是tRNA和相关的氨基酸通过氨酰tRNA合成酶结合的位点。

tRNA另一个显著的特征就是存在一些特殊的碱基，这些特殊的碱基是多核苷酸链的正常碱基在转录后由酶修饰作用形成的。 5. tRNA都有三叶草型的二级结构：

答：tRNA三叶草型结构主要特征是有一受体臂、3个茎环（分别为ΨU环、D环和反密码子环）和第四个可变环。

6. tRNA具有L状的三维结构：

答：三种相互作用使L状结构得以稳定。第一，三维结构中相互靠近的不同螺旋区域的碱基间的氢键，这些通常是非常规（非Watson-Crick）键；第二，碱基和磷酸核糖骨架之间的相互作用；第三，因形成两个延伸的碱基配对区域而获得的碱基堆积作用。 7. 氨基酸通过高能酰基连接到tRNA 3’端的腺苷酸上使tRNA负载：

答：连接了氨基酸的tRNA分子称为负载的（charged）tRNA，未连接氨基酸的tRNA称为空载的（uncharged）tRNA。

8. 氨基酰tRNA合成酶分两步使tRNA负载： 答：第一步是腺苷酰基化（adenylylation）。其中氨基酸和ATP反应形成氨基酰—腺苷酸，并同时释放出焦磷酸。第二步是tRNA负载（tRNA charging）。氨基酰—腺苷酸（仍然与氨基酰tRNA合成酶紧密结合）与tRNA反应，这一反应导致氨基酸通过2’或3’羟基被转移到tRNA的3’端，同时释放出AMP。

tRNA合成酶分两类。Ⅰ类酶将氨基酸连接到tRNA的2’羟基，并且通常是单聚体；Ⅱ类酶将氨基酸连接到tRNA的3’羟基，并且通常是二聚体或四聚体。 9. 每种氨基酰tRNA合成酶连接一个氨基酸到一个或多个tRNA上： 答：20种氨基酸的每一种都是通过单独专门的tRNA合成酶连接到正确的tRNA上的。由于大多数的氨基酸是由多于一个的密码子决定的，因此由一个合成酶识别多于一个tRNA（称为同工tRNA，isoaccepting tRNA）并使之负载氨基酸。只有一种tRNA合成酶将每个氨基酸连接到所有正确的tRNA上。

大多数的生物具有20种不同的tRNA合成酶。

10. tRNA合成酶识别同族tRNA（cognate tRNA）的独特结构：

答：特异性的决定因素集中在tRNA分子的两个不同的位点：受体臂和反密码子环。 11. 氨基酰tRNA的形成时非常精确的。

12. 某些氨基酰tRNA合成酶利用编辑口袋来高精度地负载tRNA。 13. 核糖体不能辨别tRNA的负载是否正确。

14. 核糖体是由一个大亚基和一个小亚基组成的：

答：核糖体是由RNA和蛋白质组成的大亚基和小亚基两个部件组成的。大亚基含有肽基转移酶中心（peptidyl transferase center），负责肽键的形成。小亚基含有解码中心（decoding center），负载氨基酸的tRNA在此阅读或“解码”mRNA的密码子单位。 15. 大、小亚基在翻译的每次循环过程中都经历结合与分离：

答：翻译机制的中心是循环，每一个循环包括大、小亚基之间及其与mRNA的结合，翻译mRNA，然后各自分离。这种结合和分离称为核糖体循环（ribosome cycle）。

虽然一个核糖体一次只能合成一条多肽，但每个mRNA分子却能同时被多个核糖体结合同时进行翻译（简便起见，我们假设mRNA是单顺反子的）。结合多个核糖体的mRNA称为多核糖体（polyribosome或polysome）。 16. 新的氨基酸连接在延伸肽链的C端。

17. 肽键是通过将正在延伸的多肽链从一个tRNA转移到另一个tRNA而形成的。 18. 核糖体RNA是核糖体中的结构和催化决定因子：

答：核糖体RNA并不单单是核糖体的结构成分，相反，它们还直接负责核糖体的关键功能。 大多数的核糖体蛋白质位于核糖体的周边，而非其内部。 19. 核糖体有3个tRNA结合位点：

答：核糖体含有3个tRNA结合位点，分别为A、P和E位点。A位点（A site）是氨基酰tRNA的结合位点，P位点（P site）是肽基酰tRNA的结合位点，E位点（E site）是延伸的多肽链转移到氨基酰-tRNA后释放的tRNA的结合位点（E指exit，退出）。 20. 穿过核糖体的通道可以使mRNA和多肽链进出核糖体：

答：mRNA通过小亚基的两个狭窄的通道进出解码中心。mRNA的两个密码子之间存在明显的扭结（kink），有利于维持正确的可读框。这个扭结使核糖体易位后留在空着的A位点的密码子处于一个独特的位置，阻止随后的氨基酰-tRNA结合于毗邻该密码子的碱基上。 大亚基上的另一个通道提供了新合成的多肽链离开（核糖体）的途径。与mRNA的通道一样，这个通道的大小限制了多肽链的折叠。 21. 翻译起始：

答：翻译要成功地起始，必须有3个事件发生。第一，核糖体必须被募集到mRNA上；第二，负载tRNA必须置于核糖体的P位点；第三，核糖体必须精确地定位在起始密码子上。其中第三条是关键的。因为这一步确定了mRNA翻译的可读框。

22. 原核细胞的mRNA最初是通过与rRNA的碱基配对而募集到小亚基上：

答：大、小亚基是一个一个地装配到mRNA上的。首先小亚基和mRNA结合。如前所述，对原核细胞来说，小亚基和mRNA的结合是由（mRNA的）核糖体结合位点和（小亚基的）16S RNA之间的碱基配对作用介导的。大亚基是在起始过程即将结束的时候加入复合体的。 23. 特定的负载着修饰甲硫氨酸的tRNA直接结合到原核细胞的小亚基上：

答：通常，负载tRNA进入核糖体的A位点并在一轮肽键合成后才能到达P位点。但是，在起始阶段，负载tRNA直接进入到P位点。这一过程需要一个称为起始tRNA（initiator tRNA）的特定tRNA，它与起始密码子（通常AUG或GUG）碱基配对。起始tRNA上负载的既非Met亦非Val。相反，它负载的是一种Met的修饰产物：在氨基基团上连着一个甲酸基（N-甲酰甲硫氨酸，N-formyl methionine），负载此氨基酸的起始tRNA称为fMet-tRNAifMet。 24. 三种起始因子知道包含mRNA和起始tRNA的起始复合物的装配： 答：原核细胞的翻译始于小亚基，由3中翻译起始因子（translation initiation factor）——IF1、IF2和IF3所催化，每一个因子催化起始过程的一个关键步骤：

IF1防止tRNA结合到小亚基未来A位点的位置上。 IF2是GTP酶（结合和水解GTP的蛋白质），它与起始过程的3个主要成分（小亚基、IF1和fMet-tRNAifMet）相互作用。通过与这些成分相互作用，IF2催化了fMet-tRNAifMet和小亚基的结合，并阻止其他负载tRNA与小亚基结合。

IF3结合于小亚基并阻止其与大亚基结合，或阻止其与负载tRNA结合。由于翻译起始需要游离的小亚基，因此IF3与小亚基的结合对翻译的每一轮新的循环是十分重要的。IF3在上一轮循环即将结束时开始于小亚基结合，并协助70S核糖体分解为大、小亚基。

随着3个起始因子的加入，小亚基已经准备好结合mRNA和起始tRNA了。这两种RNA能以任何一种方向结合，并且相互独立。（小亚基）结合mRNA通常是（mRNA的）和它结合位点和（小亚基的）16S RNA之间的碱基配对作用介导的。而fMet-tRNAifMet结合小亚基是由结合GTP的IF2催化的，并且（一旦mRNA结合于小亚基上）通过反密码子和mRNA的起始密码子之间的碱基配对作用。

起始的最后步骤涉及大亚基的聚合以形成70S起始复合体（70S initiation complex）。当起始密码子和fMet-tRNAifMet的碱基配对后，小亚基的构象发生变化导致IF3的释放。在IF3离开的情况下，大亚基可以自由地与小亚基及其负载的IF1、IF2、mRNA和fMet-tRNAifMet结合。大亚基的结合激活了IF2-GTP酶活性，引起GTP的水解。水解后的IF2-GDP与核糖体和起始tRNA的亲和力降低，导致IF2-GDP和IF1从核糖体释放出来。这样，起始过程的最后产物是在mRNA的起始位点组装了一个完整的（70S）核糖体，其P位点有fMet-tRNAifMet，而A位点是空的。

25. 真核细胞的mRNA通过5’帽吸引核糖体：

答：在真核细胞中，小亚基在被吸引到mRNA的5’端帽子结构之前，已经与起始tRNA结合。然后以5’→3’方向沿着mRNA“巡视”直到遇见第一个有正确上、下游序列的5’

-AUG-3’，该密码子被识别为起始密码子。

与原核细胞不同的是，真核细胞起始tRNA和小亚基的结合总是发生在和mRNA结合之前。当真核细胞的核糖体完成翻译的一个循环后，通过与原核的IF3和IF1相对应的（分别称为eIF3和eIF1A）因子的作用解离为游离的大、小亚基。两个GTP-结合蛋白——eIF2和eIF5B介导了（小亚基）和负载起始tRNA的结合。对真核细胞来说，起始tRNA负载的是Met，而非N-fMet，称为Met-tRNAiMet。eIF5B-GTP帮助eIF2-GTP和Met-tRNAiMet的复合体结合到小亚基上。通过协同作用，这两个GTP结合蛋白将Met-tRNAiMet安置于小亚基未来的P位点，最后形成43S起始前复合体（43S pre-initiation complex）。

43S起始前复合体对mRNA的识别是从对5’帽结构的识别开始的，这一结构存在于大多数真核细胞的mRNA上。这一识别过程由具有3个亚基的eIF4F介导。其中的一个亚基直接与5’帽结构相结合，其他的两个亚基与RNA非特异性地结合。随后，eIF4B加入到这一复合体上，并激活eIF4F中一个亚基的RNA解旋酶的活性。解旋酶解开mRNA末端的任何二级结构（如发夹结构）。eIF4F/B与展开的mRNA的结合体通过eIF4F和eIF3的相互作用募集43S起始前复合体到mRNA上。

26. 起始密码子是通过核糖体从mRNA的5’端向下游（3’端）“巡视”而找到的： 答：一旦在mRNA的5’端组装好，小亚基和它的结合因子就按照5’→3’方向沿着mRNA移动，这一移动是依赖于ATP的，由eIF4F的RNA解旋酶所驱动。在移动过程中，小亚基寻找mRNA的起始密码子。起始密码子的识别是通过起始tRNA的反密码子和起始密码子之间的碱基配对作用（这就是为什么起始tRNA先与小亚基结合，而后与mRNA结合的原因）。正确的碱基配对引起eIF2和eIF3的释放。eIF2（防止大亚基的结合）和eIF3（结合于起始tRNA）的脱离使得大亚基结合到小亚基上。与原核细胞的情况相同，大亚基的结合刺激了eIF5B-GTP（与原核的IF2相似）的水解，导致剩余的起始因子释放。这些事件的结果是，Met-tRNAiMet被置于新的80S起始复合体（80S initiation complex）的P位点。 27. 翻译起始因子使真核mRNA保持环状：

答：除了与mRNA的5’端结合，起始因子通过poly-A尾与mRNA的3’端紧密结合。这是通过eIF4F和包绕在poly-A尾结合蛋白（poly-A binding protein）之间的相互作用实现的。 28. 翻译延伸：

答：为了使氨基酸能正确加入，有3个关键的事件是必须发生的。首先，在A位点上的密码子的指导下，正确的氨基酰tRNA置于A位点上；第二，A位点的氨基酰tRNA与P位点的肽酰tRNA上的肽链形成肽键，这一肽转移酶（peptidyl transferase）反应导致多肽链从P位点的tRNA上转移到A位点的负载tRNA的氨基酸残基上；第三，形成的A位点的肽酰tRNA和相应的密码子必须易位（translocate）至P位点，以使核糖体为下一循环的密码子识别和肽键形成做好准备。

29. 氨基酰tRNA由延伸因子EF-Tu送达A位点：

答：与起始因子IF2一样，延伸因子EF-Tu结合并水解GTP，并且鸟嘌呤核苷酸的类型决定了EF-Tu的功能。只有当EF-Tu与GTP结合后，EF-Tu才能结合氨基酰tRNA。结合氨基酰tRNA的EF-Tu不能有效地水解GTP。激活EF-Tu GTP水解酶活性的“扳机”是与大亚基加入起始复合体时激活IF2 GTP水解酶的大亚基的同一个结构域。这一结构域称为因子结合中心（factor binding center）。只有当tRNA置于A位点和正确的密码子-反密码子配对后，EF-Tu才能与因子结合中心相互作用。然后，EF-Tu水解结合的GTP，并从核糖体中释放出来。

30. 核糖体利用多种选择机制排斥错误配对的氨基酰tRNA： 答：至少有3中不同的机制促成了翻译的高准确率：

其中一个关于密码子识别忠实性的机制涉及小亚基16SrRNA的两个相连腺嘌呤残基。

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