基因的分子生物学读书笔记(4)

state），或者导致噬菌体的增殖，即进入裂解性生长（lytic growth）过程。

为实现整合，整合酶蛋白（λInt）在两个特定位点之间催化重组的进行，这两个位点叫做att位点，或者附着位点。attP位点在噬菌体上（P代表噬菌体），attB位点在细菌染色体上（B代表细菌）。λInt是一个酪氨酸重组酶，所催化的单链交换机制遵循前面介绍的Cre蛋白的催化过程。然而，与Cre重组不同的是，λ整合需要辅助蛋白的帮助来组装所需的蛋白质－DNA复合体。

整合过程要求attB、attP、λInt，以及一个叫做整合宿主因子（integration host factor，IHF）的构筑蛋白的参与。

7. λ噬菌体的切除需要一个新的折叠DNA蛋白质：

答：一个由噬菌体编码的构筑蛋白对切除重组至关重要，这个蛋白质叫做Xis（即切除），它结合到特定的DNA序列上并造成DNA的弯曲。

除了促进切除过程（attL和attR之间的重组）以外，Xis结合到DNA上也抑制了整合过程（attP和attB之间的重组）。

8. Hin重组酶颠倒一段DNA片段，使得特定基因开始表达： 答：Hin重组是一类重组反应的代表，这些重组在细菌中是相当普遍的，被称为程序性重排。它的功能通常是让一部分细菌能够对周围环境的突然变化获得“预适应”。 9. Hin重组过程需要一个DNA增强子：

答：Hin重组过程除了需要hix位点外，还需要一段序列。这截短短的序列（约60bp）是一个增强子，它能将重组率提高1000倍左右。

增强子-Fis蛋白的复合体激活了重组的催化步骤。Hin可以在没有Fis-增强子复合体存在的情况下与hix重组位点结合、配对，形成联合复合体。 10. 重组酶将多聚环形DNA分子转换成单体：

答：位点特异性重组对细胞中环状DNA分子的维护起到关键作用。

Xer重组酶催化了细菌染色体以及很多细菌质粒的单体化过程。Xer是酪氨酸重组酶家族的一个成员，它的重组机制与前面讲过的Cre蛋白很相似。Xer是一个异源四聚体，包含两个XerC蛋白亚基和两个XerD蛋白亚基。Xer催化的重组位点必须要包含这两种识别序列。该位点在细菌染色体上叫做dif位点。

当FtsK蛋白存在并与XerCD复合体发生相互作用后，复合体的构象发生改变，XerD蛋白被激活。这时，XerD催化第一对单链的重组，产生Holliday联结体；反应完成后，XerC催化第二对单链的交换反应，产生重组后的DNA产物。

FtsK是一个膜结合蛋白，它被定位于细胞中发生细胞分裂的地方，其作用是在细胞分裂前将DNA从细胞中央移开，使细胞可以正常分裂。 11. 转座：

答：转座是一种特殊的遗传重组，它是将特定的遗传因子从DNA上的一个地方移位到另一个地方。这些可以移动的遗传因子叫做转座因子（transposable element）或转座子（transposon）。

三类基本的转座因子：

根据转座子的结构及其转座机制，可将其分为以下3个家族： 1. DNA转座子。

2. 类病毒反转录转座子，包括反转录病毒。这些因子又称为LTR反转录转座子。 3. 聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子。这类因子又称为非病毒反转录转座子。 12. DNA转座子上带有一个转座酶基因，两端是重组位点：

答：转座因子两端的重组位点以反向重复序列排布，这些末端反向重复序列的长度从25到几百碱基对不等。催化转座的重组酶通常叫做转座酶（transposase）[有时也叫整合酶

（integrase）]。

DNA转座子带有编码自己的转座酶的基因，也可能会携带一些其他基因，这些基因编码的蛋白质可能调节转座，也可能为转座因子或宿主细胞提供一些有益的功能。 13. 转座子包括自主转座子和非自主转座子：

答：带有一对末端反向重复序列和一个转座酶基因的DNA转座子，本身具备了催化自身转座的所有条件，这类因子叫做自主转座因子（autonomous transposon）。然而，在基因组上还有很多比较简单的可移位DNA片段，叫做非自主转座子（nonautonomous transposon），它们仅有末端反向重复序列，即转座所需的cis-acting序列。细胞中自主转座子表达的转座酶会识别这些末端反向重复序列，从而帮助非自主转座因子发生移位。

14. 类病毒反转录转座子和反转录病毒带有末端重复序列和两个对重组很重要的基因： 答：类病毒反转录转座子和反转录病毒也带有反向末端重复序列，它们是重组酶结合和作用的位点。类病毒反转录转座编码联众移位所需的蛋白质：整合酶（转座酶）和反转录酶。 15. 像基因的聚腺苷酸反转录转座子：

答：聚腺苷酸反转录转座子没有其他转座子所带的末端反向重复序列，反而，它的两端含有完全不同的序列成分。一端称为5’UTR（非翻译区），另一端是3’UTR，它带有一串叫做聚腺苷酸序列（poly-A sequence）的A-T碱基对。 反转录转座子带有两个基因，ORF1和ORF2。 16. DNA转座的剪切－粘贴机制：

答：DNA转座子非复制性移位的机制。这个重组过程包括转座子从DNA上初始位置的切除以及将这个切下来的转座子整合到一个新的DNA位点，因此把这个机制叫做剪切－粘贴转座（cut-and-paste transposition）。

一旦转座酶识别了这些序列，它就将这两端聚集在一起形成一个稳定的蛋白质-DNA复合体，这个复合体被称为联合复合体（synaptic complex）或转座体（transpososome）。

下一步是将转座子DNA从基因组的原始位置上切除。转座子上的转座酶亚基先断裂转座子两端的一条单链。转座酶切断DNA后，转座因子DNA末端带有游离的3’羟基基团。两端的另一条DNA单链也需要被切断，而不同的转座子断裂这第二条单链的机制各不相同。

转座子被切除后，被转座酶首先释放的3’端羟基对新插入位点的DNA磷酸二酯键进行攻击，被攻击的DNA片段叫靶DNA（target DNA）。

剪切－粘贴转座中的中间体由缺口修复来完成。

不同的转座子催化第二条单链断裂反应的机制这里介绍3种方法： 非转座酶可用来断裂非转移单链。

断裂非转移链的其他方法由转座酶自身完成，它用一种不常见的DNA酯基转移机制，其过程与DNA单链转移相似。例如，在Tn5和Tn10转座子断裂非转移链时就产生一个“DNA发卡”结构。

然后发卡DNA的末端被转座酶断裂（打开），产生一个标准的双链DNA断裂，打开反应在转座子DNA两端同时进行。

转座子两端DNA的断裂也可以通过一个酯基转移反应完成，这是转座子断裂非转移链的第三种机制。在这种断裂中，一个断裂的3’端攻击转座因子上同一单链的另一端，产生的DNA中间体进一步反应得到切除的转座子。 17. DNA的复制性转座：

答：复制性转座的第一步是转座酶蛋白和转座子DNA两端装配成一个转座体。

第二步是转座子末端DNA的断裂。

然后，转座子DNA的3’－OH末端通过DNA单链的转移反应被连接到靶DNA位点上。但是，这里产生的中间体是双交叉的DNA分子。在此中间体中，转座子的3’端被共

价连接到新的靶位点，而5’端仍连在原处。

中间产物的两个DNA交叉成为一个复制叉结构。以断开的靶DNA 3’端为引物进行DNA合成，复制过程一直进行到第二个交叉处，此复制反应产生2个拷贝的转座子DNA，复制产物两端是短小的正向排列靶位点重复序列。

复制性转座常常会造成染色体的倒位和丢失。

18. 类病毒反转录转座子和反转录病毒通过一个RNA中间体实现移位：

答：类病毒反转录转座子和反转录病毒插入到宿主细胞基因组的新位点，所用的DNA断裂及DNA单链转移步骤与前面讲的DNA转座相同。但不同的地方时，这些反转录因子的重组需要一个RNA中间体的参与。

转座周期开始于反转录转座子（或反转录病毒）DNA序列在细胞内的RNA聚合酶的催化下转录得到RNA。转录起始于LTR中的一个启动子序列，一直穿过整个因子得到转座因子的一个几乎全长的RNA拷贝，然后RNA反转录成一个双链DNA分子，这个DNA分子叫做cDNA（复制的DNA），它游离于宿主DNA序列之外。

这个cDNA能够被整合酶（与DNA因子的转座酶高度相关的一种蛋白质，下面将会看到）识别并被重组到一个新的靶DNA位点。整合酶结合到cDNA的一端，然后从每条单链的3’端切下几个核苷酸，这个断裂反应与DNA转座子的DNA断裂步骤相同。

DNA转座酶和反转录整合酶同属于一个蛋白超家族。

19. 聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子通过一种“反向剪切”机制进行移位：

答：聚腺苷酸反转录转座子，如人的LINE因子的移位需要一个RNA中间体，但其转座机制与类病毒转座因子有所不同，它的机制叫做靶位点引导反转录（target site primed reverse transcription）。首先是细胞内RNA聚合酶对整合因子的转录。尽管启动子在5’UTR内，这是它能指导RNA合成起始于转座因子序列的第一个核苷酸。

新合成的RNA被转运到细胞质中翻译成ORF1和ORF2两个蛋白质。这些蛋白质保持与编码它们的RNA相结合。

这个蛋白质-RNA复合体重新进入核内并与细胞DNA结合。 20. 转座子及其调节的实例：

答：IS4家族的紧密型转座因子通过多种机制实现对拷贝数的控制。

Tn10的转座伴随着细胞DNA的复制。

Mu噬菌体通过靶位点免疫来避免其转座到自身DNA上。 Tc1/mariner因子是真核细胞中极其成功的DNA转座因子。 酵母Ty因子转座到基因组的安全港。

LINE因子能够推动自身转座，还能转座细胞RNA。

21. V（D）J重组中的早期活动是通过一种类似于转座子切除的机制实现的。

第3篇 基因组的表达 第12章 转录机制

知识点：

1. 转录机制与复制机制的区别： 答：（1）转录得到的新链是由核糖核苷酸组成的，而不是脱氧核糖核苷酸。

（2）RNA聚合酶（RNA polymerase，催化RNA合成的酶）不需要引物，它能够从头起始转录（尽管，如我们将要讨论的，细胞内的转录必须在特定的序列上才能起始）。

（3）RNA产物不与模板DNA链的碱基保持互补状态。

（4）转录尽管是非常精确的（每添加10 000个核苷酸会发生一次错误），但还是不如复制更为精确（每10 000 000个核苷酸发生一次错误）。 （5）转录仅是有选择性地复制基因组的特定部分，并从任何特定的部分产生一个到几百个，或者甚至上千个拷贝。

（6）转录区域的选择并不是随机的；每个转录区域通常包括一个或多个基因，而且在每个转录区域的首端和尾端都存在特定的DNA序列指导转录的起始和终止。 2. RNA聚合酶具有不同形式：

答：细菌只有一种RNA聚合酶，而真核细胞中则有3中：RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）是负责转录大多数基因的酶——实际上，是转录几乎所有蛋白质编码基因的酶。聚合酶Ⅰ（Pol Ⅰ）和聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）分别参与转录专门的RNA编码基因。具体来说，Pol Ⅰ转录的是大核糖体RNA前体基因，而Pol Ⅲ转录的是tRNA的基因、一些小的核RNA的基因和5S rRNA的基因。

3. 为转录一个基因，RNA聚合酶要进行一系列定义明确的步骤，这些步骤分为3个阶段

（phase）： 答：（1）起始（initiation）：启动子（promoter）是最初结合RNA聚合酶的DNA序列（在很多情况下是与转录起始因子一起结合的）。启动子-聚合酶复合体一旦形成就发生结构改变，以使起始过程继续进行。 （2）延伸（elongation）：一旦RNA聚合酶已经合成了一小段RNA（10个碱基左右），转录便进入了延伸阶段。这一转变需要聚合酶构象的进一步改变，以使其能够更牢固地与模板结合。在延伸阶段，RNA聚合酶除催化RNA的合成外，还执行着多项重要任务。它解开前方的DNA，又使后方的DNA重新复性；在移动的同时，逐步分开正在延长的RNA链与模板的配对；而且还执行校正的功能。 （3）终止（termination）：一旦RNA聚合酶转录了整个基因（或整组基因），它必须停下来并释放RNA产物。这一步骤称为终止。在某些细胞中，存在着特定的、已研究清楚的引发终止的序列；而在其他一些细胞中，是什么使聚合酶停止转录并从模板上分离，还不十分清楚。

4. 转录起始包括三个定义明确的步骤：

答：转录周期（transcription cycle）的第一个阶段——起始又可以分为一系列定义明确的步骤。

第一步是聚合酶与启动子初步结合形成所谓的闭合式复合体（closed complex），这时DNA还保持着双链状态，聚合酶结合在螺旋的一个面上。

第二步是闭合式复合体经过转变而成为开放式复合体（open complex），DNA双链在起始位点周围大约14bp的距离内分开以形成转录泡。

第三步，最初的大约10个左右的核糖核苷酸的结合是一个效率相当低的过程，在这一阶段，聚合酶经常释放出很短的转录物（每一个都短于10个左右的核苷酸），然后再重新开始合成。一旦某个聚合酶超过了10bp，就可以说它逃离了启动子。这时，它已经形成了一个稳定的三重复合体（stable ternary complex），包括酶、DNA和RNA。 5. 细菌的启动子在强度和序列上是多样的，但是具有某些明确的特征：

答：一个称为ζ的起始因子的添加，使得核心酶转变为只在启动子处起始转录的形式。该酶的这种形式称为RNA聚合酶的全酶（holoenzyme）。

在大肠杆菌中，最常见的ζ因子称为ζ70。含有ζ70的聚合酶识别的启动子具有以下共同的特征性结构：两段6个核苷酸长的保守序列，被长为17~19个核苷酸的非特异序列所分割。这两段序列称为﹣35和﹣10区域（region）或元件（element）。

具有与共有序列更近似的序列的启动子通常要比那些匹配较差的启动子“更强”。所谓启动子的强度，我们是指一个启动子在一定的时间内可以起始多少个转录物。

在一些较强的启动子中，如在指导核糖体RNA（rRNA）基因表达的启动子中，发现了一个额外的与RNA聚合酶结合的DNA元件，称为UP元件（UP-element）。它可以通过提供额外的特异性相互作用而增强聚合酶与DNA的结合。

另一类型的ζ70启动子缺乏﹣35区域，而是由一个所谓的“延长的﹣10区域”元件。 6. σ因子介导聚合酶与启动子的结合：

答：ζ70因子可以分为4个区域，称为ζ区域1~ζ区域4。

区域4内的两个螺旋形成一个常见的DNA结合基序，称为螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）。其中一个螺旋插入到﹣35区域的大沟（major groove）中并与该区的碱基相互作用；另一个则从大沟的顶部横过，与DNA骨架接触。

﹣10区域也被一个α螺旋所识别。但是其相互作用尚未彻底研究清楚而且更为复杂。 延长的﹣10元件，如果存在的话，被ζ区域3中的一个α螺旋所识别，此螺旋与组成这一元件的两个特异性的碱基对接触。

与启动子内的其他元件不同，UP元件并不被ζ因子所识别，而是由α亚基的羧基末端域（αCTD）来识别。

7. 向开放式复合体的转变过程涉及RNA聚合酶和启动子DNA的结构变化：

答：从闭合式复合体到开放式复合体的转变过程涉及聚合酶的结构变化，以及DNA双链的打开，从而暴露出模板链和非模板链。相对于转录起始位点而言，这一“融化”发生在﹣11和﹢3之间的区域。

对于含有ζ70因子的细菌聚合酶，这一转变常被称为异构化作用（isomerization）。 首先，位于聚合酶前部的钳子牢固地钳压在下游DNA上；第二，ζ的N端区域（区域1.1）的位置有一个重要的移动，在未结合DNA时，ζ区域1.1处于全酶的活性中心裂隙内部，阻断着开放式复合体中模板DNA链经过的路线。在开放式复合体中，区域1.1移动了大约50?的距离，出现在酶的外部，使得DNA可以进到裂隙中。 8. 转录由RNA聚合酶起始，不需要引物：

答：聚合酶必须与起始核苷酸建立特异性的相互作用，严格控制其处于正确的方向，使其可以对引入的核苷三磷酸开始进行化学反应。此相互作用对A是特异的，因而只有以A开始的链才能以适于高效起始的方式固定。

9. RNA聚合酶在进入延伸阶段之前会先合成几段短的RNA：

答：一旦核苷酸进入了活性中心裂隙并且RNA开始合成，接下来就进入了称为流产性起始（abortive initiation）的时期。在这一阶段，聚合酶会合成一些长度小于10个核苷酸的RNA分子。

ζ因子的一个区域再一次作为一个分子模拟物参与了此过程。这一次是区域3.2，模拟的是RNA。ζ的这一区域位于开放式复合体的RNA出口通道的中部，为了使合成长度超过大约10个核苷酸的RNA链，ζ的这一区域必须从此位置上被逐出，这个过程需要聚合酶尝试几次才能成功。

10. 延伸聚合酶是一个边合成边校对RNA的向前行进的机器：

答：DNA通过延伸酶的形式与通过开放式复合体相似，双链DNA在两个钳子之间进入酶的前部。在催化裂隙的开口处，两条链分别沿着不同的路径穿过酶，然后从各自的通道离开酶，并在延伸聚合酶（elongation polymerase）的后面重新形成双螺旋结构。核苷酸通过其固定的通道进入活性位点，并在模板DNA链的引导下添加到增长中的RNA链上。

除了所有这些功能外，RNA聚合酶还执行着两项校对（proofreading）功能。第一个称为焦磷酸化编辑（pyrophosphorolytic editing）。在这一情况下，聚合酶利用它的活性位点，

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