基因的分子生物学读书笔记(3)

答：最简单的突变是一种碱基变成另一种碱基，有两种类型，转换（transition），即嘧啶到嘧啶和嘌呤到嘌呤的替换，如T到C和A到G；颠换（transversion），即嘧啶到嘌呤和嘌呤到嘧啶的替换，如T到G或A以及A到C或T。另一种简单的突变是一个核苷酸或少量核苷酸的插入或缺失。改变单个核苷酸的突变被称为点突变（point mutation）。

其他类型的突变引起DNA的改变较大，如大范围的插入和缺失以及染色体结构的整体重排。

2.有些复制错误能逃脱校正读码：

答：有些错误插入的核苷酸逃脱检测并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。 3.错配修复能将逃脱校正读码的错误去除：

答：保证DNA复制忠实性的最后负责由错配修复系统（mismatch repair system）承担，它将DNA合成精确性又提高了2~3个数量级。

在大肠杆菌中，错配是由错配修复蛋白MutS的二聚体来检测的。MutS扫描DNA，从错配引起DNA骨架的扭曲变形上识别出它们。

E. coli的Dam甲基化酶（DAM methylase）使两条链上的5’-GATC-3’序列中的A残基都甲基化。当复制叉经过两条链的GATC都甲基化（全甲基化）的DNA时，产生的子代DNA双链就是半甲基化的（只有母链是甲基化的）。

甲基化使在复制发生错误的时候，使E. coli修复系统能够从母链上找回正确序列的“记忆”设备。

真核细胞也能修复错误配对，它们使用MutS（MutS类似物称为MSH蛋白）和MutL（MutL类似物称为MLH的PMS）的类似物完成这一功能。 4.DNA的水解和脱氨基作用可自发产生损伤： 答：最频繁和最重要类型的水解损伤时胞嘧啶碱基的脱氨基。胞嘧啶可自发进行脱氨基作用，从而产生非天然的（在DNA中）碱基尿嘧啶。腺嘌呤和鸟嘌呤也易于自发脱氨基，脱氨基将腺嘌呤转变成次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤。DNA还通过N-糖苷键的自发水解进行去嘌呤化（depurination），并在DNA中形成脱碱基位点（即脱氧核糖上没有碱基）。 5’-甲基胞嘧啶脱氨基产生胸腺嘧啶，不能明显被识别为异常碱基。 5.DNA的烷化反应、氧化反应和辐射损害：

答：DNA易于受烷化反应、氧化反应和辐射损害。在烷化反应中，甲基或乙基基团被转移到碱基的反应位点以及DNA骨架的磷酸上。

·

DNA还易受到活性氧簇的攻击（如O2-、H2O2和OH）。这些强烈的氧化剂由致电离辐射和产生自由基的化学试剂产生。

另一种碱基损伤时紫外线造成的。260nm左右波长的辐射被碱基强烈吸收，其后果之一是在同一多核苷酸链相邻位置上的两个嘧啶之间发生光化学融合。

γ辐射和X射线（电离辐射）有很高的危险性，因为它们可使DNA双链断裂，这很难被修复。某些抗癌药物，如争光霉素也能引起DNA的断裂。电离辐射和像争光霉素那样的试剂，因能导致DNA断裂，所以被认为具有诱裂性（clastogenic）。 6.突变还可由碱基类似物和嵌入剂引起：

答：突变还可由可替换正常碱基的化合物（碱基类似物，base analog）或能插入碱基间的化合物（嵌入剂，intercalating agent）导致复制错误而引起。 7.DNA损伤的修复：

答：如我们所看到的那样，DNA的损伤有两种后果。有些类型的损伤，如胸腺嘧啶二聚体或DNA骨架的切口和断裂，使得复制或者转录受阻。其他类型的损伤产生改变了的碱基，在复制上没有立即产生结构性后果，但是引起了错配，这可在复制之后导致DNA序列上永久性的改变。

DNA损伤修复的系统。这些系统最直接的方式是（指真正的修复）修复酶简单地将损伤逆转（撤销）。一个更精致的步骤涉及剪切修复系统（excision repair system），此处受损的核苷酸没有被修复，而是从DNA上被除去。有两种剪切修复，一种仅仅将受损的核苷酸去除，另一种将包含损伤的一小段单链DNA去除。

但是，更精致的系统是重组修复（recombinational repair），当DNA两条链都受损（断裂）时采用这种修复。在重组修复[也叫双链断裂修复（double-strand break repair）]中，序列信息从染色体第二条未受损的拷贝上找回。最后，当DNA聚合酶的复制进程被受损碱基阻碍的时候，一个特殊的移损（translesion）聚合酶以一种不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点进行拷贝。因为移损合成不可避免地具有很高的错误易发性（诱变性），所以细胞在迫不得已的情况下才采用此机制。 8.DNA损伤的直接逆转：

答：损伤简单逆转修复的一个例子是光复活作用（photoreactivation），光复活作用直接逆转紫外辐射造成的嘧啶二聚体结构。

直接逆转的另一个例子是甲基化碱基O6-甲基鸟嘌呤上的甲基被去除。 9.碱基切除修复酶通过碱基弹出机制除去受损碱基：

答：DNA清除受损碱基最普遍的方法是通过修复系统将已变化的碱基除去并替换掉。两种主要的修复系统是碱基切除修复（base excision repair）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）。在碱基切除修复中，一种称为糖基化酶（glycosylate）的酶识别并通过水解糖苷键除去受损碱基。在随后的核酸内切步骤中，产生的脱碱基戊糖从DNA骨架上去除。

在倾向于和A发生错配的oxoG例子中存在一种防故障机制。一种专门的糖基化酶可识别模板链上oxoG配对位置错误掺入A产生的oxoG：A碱基对。然而在这种情况下，糖基化酶会除去A。因此，修复酶把与oxoG配对的A认作突变，并除去虽没有受损但是却不正确的碱基A。

另一个防故障系统的例子是除去与G配对的T的糖基化酶。 10.核苷酸切除修复酶在损伤两侧切割受损的DNA：

答：与碱基切除修复不同，核苷酸切除修复酶不能区分各种不同的损伤，而是识别双螺旋形状上的扭曲。这种扭曲引发一连串的事件，导致含有损伤的一小段单链片段（或小区）被去除。去除修复在DNA上产生的单链缺口由DNA聚合酶用未受损的链为模板进行填补，从而恢复原始的核苷酸序列。

核苷酸切除修复不仅能修复整个基因组中的损伤，而且当RNA聚合酶的转录过程被某个基因中发生的转录（模板）链的损伤所终止时，它还能拯救RNA聚合酶。此现象叫做转录偶联修复（transcription-coupled repair），包括将核苷酸切除修复蛋白募集到受阻的RNA聚合酶上。

11.重组修复通过从未受损DNA中找回序列信息来修复DNA断裂：

答：切除修复用未受损的DNA链作为模板来代替另一条链上已受损的DNA片段。细胞如何修复DNA中双螺旋两条链都断裂的双链断裂呢？这是由双链断裂修复（DSB）途径

[double-strand break（DSB） repair pathway]进行的。此途径从姐妹染色体中取回序列信息。

DNA重组还帮助修复DNA复制中的错误。

异源末端连接（NHEJ）的防故障系统发挥作用。NHEJ不涉及同源重组。取而代之的是，通过断裂末端突出的单链之间错排配对，断裂DNA的两个末端直接相互连接。此错排配对是通过小段（可以短至一个碱基对）互补碱基之间的匹配完成的。 12.移损DNA合成使复制通过DNA损伤继续进行：

答：细胞不能修复损伤，也有防故障机制使复制机器绕过受损的部位。这种机制就叫做移损合成（translesion synthesis）。

移损合成时被一类特化的DNA聚合酶催化的，此酶越过损伤部位直接合成DNA。 这些聚合酶一个重要的性质就是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们掺入核苷酸的方式不依赖于碱基配对。

第10章 分子水平上的同源重组

知识点：

1. 同源重组的“模式”都包括以下几个关键步骤： 答：①同源DNA分子的联会。

②引入DNA断裂。

③在两条重组DNA分子之间，形成碱基互补的短片段起始区。当来自于亲本分子的DNA分子单链区域与同源双链DNA分子互补链配对结合时，发生该配对过程，称为链侵入（strand invasion）。链侵入的结果是，两个DNA分子被相互交叉的DNA链联系在一起。这个交叉结构被称为Holliday联结体（Holliday junction）。

④Holliday联结体的剪切。在Holliday联结体处切断DNA重新生成两个分开的双螺旋DNA，从而完成遗传物质的交换过程。这个过程叫做拆分（resolution）。 2. Holliday模型揭示了同源重组的关键步骤：

答：Holliday模型很好地解释了DNA链侵入、分支移位和Holliday联结体拆分等同源重组的核心过程。

3. 双链断裂修复模型更加准确地描绘了许多重组事件：

答：同源重组经常因DNA双链断裂而启动。描述这种遗传交换反应的常用模型是双链断裂修复途径（double-stranded break-repair pathway）。始发事件是两条DNA分子中的一条发生了双链断裂（double-stranded break，DSB），而另外一条保持完整。 在双链断裂模式下，这种单向的遗传物质交流有时会留下一个遗传标记——引发基因转换（gene conversion）事件。

4. DNA双链断裂来自于多事件并启动同源重组：

答：同源重组除了能修复染色体DNA双链断裂外，还能促进细菌间的遗传物质交换。 同源重组是真核细胞中修复DNA断裂和复制叉停滞的关键步骤。 5. RecBCD解旋酶/核酸酶加工用于重组的DNA分子断端：

答：RecBCD酶作用于断裂的DNA分子以产生单链DNA区域，RecBCD也可协助链交换蛋白质RecA结合到单链DNA末端。另外，RecBCD所拥有的多种酶活性提供给细胞一种“选择”，或是与进入细胞的DNA分子发生重组，或是降解它。

RecBCD蛋白的激活受控于一段特殊的chi（cross-over hotspot instigator）DNA序列。 遇到chi位点后，RecBCD的核酸酶活性发生变化。随着RecBCD移入chi位点之外的远端序列，它不再依3’→5’方向剪切DNA，而是以更高的频率剪切另一条5’→3’方向的DNA链。这种变化的结果使一条双螺旋DNA变成有一条凸出的，chi位点位于3’端单链的DNA。这种结构适于RecA蛋白的组装，并引发链交换。

为了让RecA而不是SSB结合到DNA上，RecBCD直接与RecA结合以利于该蛋白质的组装。

6. RecA蛋白在单链DNA上组装并促进链侵入。 7. 在RecA蛋白丝的基础上建立新的配对DNA：

答：RecA催化链交换过程可以分为不同阶段。首先RecA蛋白丝必须组装在其中一个参与的DNA分子上，组装发生在具有单链DNA区域（如单链DNA末端）的DNA分子上。

RecA可促进寻找同源序列，这是因为蛋白丝结构具有两个不同的DNA结合部位：主要位点（结合第一个DNA分子）与次要位点。

当一个碱基互补的区域被定位后，RecA促进这两个DNA分子形成一个稳定的复合体。这个与RecA结合的三链结构被称为连接分子（joint molecule），通常包含杂交数百个碱基对的DNA，实际的链交换就发生在连接分子内。

8. RuvAB复合体特异性地识别Holliday联结体并促进分支移位。 9. RuvC剪切位于Holliday联结体的特定DNA链从而结束重组：

答：尽管RuvC靠识别结构而非特定序列以行使其功能，但RuvC剪切DNA还是有一定程度的序列特异性。

10. 真核细胞的同源重组具有额外的功能：

答：在减数分裂过程中，同源重组确保染色体正确配对，从而保持基因组的完整性。

染色体的不恰当分离，被称之为不分离（non disjunction）。

这种在减数分裂过程中发生的同源重组被称为减数分裂重组（meiotic recombination）。 11. 减数分裂中程序化生成的DNA双链断裂：

答：Spo11蛋白可以在很多染色体位置上切断DNA，它对序列没什么选择性，但却必须发生在减数分裂的一特定时期。

12. MRX蛋白作用于被切开的DNA末端，以组装类RecA的链交换蛋白：

答：3’端DNA链不被降解，所以此DNA处理反应称之为5’→3’端切除。MRX正是通过5’→3’的反应，从而生成长3’端单链DNA，通常可达1kb或更长。MRX酶复合物还被认为能去除与DNA相连的Spo11。

13. Dmc是专一在减数分裂重组中行使功能的类RecA蛋白：

答：真核生物编码两种被充分阐明的、与细菌RecA蛋白同源的蛋白质：Rad51和Dmc1。 14. 多种蛋白质共同促进减数分裂重组：

答：Rad52是另外一个与Rad51相互作用的必要重组蛋白。Rad52启动Rad51 DNA蛋白丝（Rad51的活性形态）的组装。

在真核生物中高度保守的Mus81蛋白，也为减数分裂所必需，或许具有Holliday联结体拆分酶的作用。

15. 交配型转换始于特定位点的双链DNA的断裂： 答：交配型转换始于MAT基因座的双链断裂，这个反应由特异的DNA切割酶——HO内切核酸酶（HO endonuclease）来完成。

HO引起的断裂，其5’→3’的DNA切除反应与减数分裂重组的机制一样。所以，切除依赖于MRX蛋白复合体，并对5’端的DNA链具有特异性，而3’端DNA链保持稳定。一旦生成长3’单链DNA尾巴，它们就结合Rad51和Rad52蛋白（和其他帮助组装重组蛋白-DNA复合体的蛋白质）

交配型的转换是单向性的，即序列信息（尽管并不是真正的DNA片段）从HMR和HML移动到MAT基因座，但是绝对不会从反方向进行。 16. 交配型转换是一种基因转变事件，与交换无关：

答：为解释缺少交换事件的基因转变的机制，提出了一种新的重组模型，称之为依赖合成的链退火（synthesis-dependent strand annealing，SDSA）。首先在重组位点引入DSB，经过链侵入之后，侵入的3’端作为引物启动新的DNA合成。值得注意的是，与DSB修复途径所不同的是，一个完整的复制叉在该处形成。前导链和后随链可同时进行DNA复制，但是与普通的DNA复制不同，新合成的链自模板上置换下来，其结果是新的双链DNA片段被合成，再连接到最初被HO内切酶切断的DNA位点上，并被MRX切除。

新合成的DNA——其亲本DNA分子信息的完全拷贝，替代原有的DNA信息。

17. 重组大致上独立于序列的事实导致一个结论，即任何两个基因间的重组频率和这些基因间的距离成正比。

18. 重组时被修复的DNA可产生基因转变。

第11章 位点特异性重组和DNA转座

知识点：

1. DNA重排的原因：

答：很多重要的DNA重排都是由两类重要的遗传重组造成的：保守性位点特异性重组（conservative site-specific recombination，CSSR）和转座重组（一般称作转座）（transpositional recombination）。

2. 发生在靶DNA上特定DNA序列的位点特异性重组：

答：保守重组的一个关键特性使发生移动的DNA片段都带有短而特殊的序列因子，叫做重组位点（recombination site），在这里可发生DNA交换。

CSSR能够产生3中不同类型的DNA重排：①一个DNA片段在特定位点的插入（如λ噬菌体DNA插入细菌染色体）；②DNA片段的丢失；③DNA片段的到位。

每个重组位点由一对对称排列的重组酶识别序列（recombinase recognition sequence）构成，识别序列中间所包围的是一个短的不对称序列，称为交换区（crossover region），DNA的断裂和重新连接就是在这里发生。

由于交换区是不对称的，所以每个重组位点都带有特定的极性。单个DNA分子上的两个位点所呈现的方向相关性为两者以反向重复（inverted repeat）或同向重复（direct repeat）的方式排列。在一对反向位点间的重组将使这两个位点间的DNA发生倒位；相反，以同样的机制发生在由两个同向重复位点间的重组将会去掉这两个位点间的DNA片段；最后，插入的情况特异性发生在当两个不同分子的重组位点在一起时所发生的DNA交换情况下。在对重组酶进行一个大概地讨论后，将介绍这3中重排类型的几个实例。

3. 位点特异性重组酶通过一个蛋白质－DNA的共价中间体对DNA进行切断和重新连接： 答：保守的位点特异性重组酶共有两个家族：丝氨酸重组酶（serine recombinase）和酪氨酸重组酶（tyrosine recombinase）。

保守性位点特异性重组（CSSR）名称中“保守”的意义：被称为“保守”是因为反应中被断开的每个DNA键都被重组酶重新连接起来，而DNA在被重组酶断开并重新连接的过程中不需要其他的能量，如ATP水解的能量。

丝氨酸重组酶诱导DNA双链断裂及链交换，促成重组。 酪氨酸重组酶每次断裂和结合一对DNA单链。 4. Cre的功能与应用：

答：Cre是P1噬菌体编码的一种酶，其功能是在浸染过程中环化线性的噬菌体基因组。Cre作用于DNA上的重组位点叫lox，Cre-lox是一个由酪氨酸重组酶家族催化重组的简单例子，整个重组仅需Cre蛋白和lox位点。Cre也是在遗传工程中被广泛使用的一个工具。 5. 位点特异性重组的生物学作用：

答：很多噬菌体的感染就是使用这种重组机制将自己的DNA插入到宿主染色体中。还有些时候，位点特异性重组被用来改变基因的表达。

所有反应的关键是重组酶与DNA的结合，即使两个重组位点聚合在一起。对于一些重组反应来说，这个结合过程很简单，仅需要重组酶和它的DNA识别序列，这与Cre的情况一样。与此相反，另外一些重组反应则需要辅助蛋白。这些辅助蛋白包括一些所谓的构筑蛋白（architectural protein），它们结合到特定DNA序列上并使其弯曲，使之成为有利于重组过程进行的特异形状。

6. λ整合酶催化病毒基因组在宿主细胞染色体上的整合和切除： 答：当λ噬菌体侵染宿主细菌时，一系列的调节活动或者导致形成静止的溶原状态（lysogenic

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