基因的分子生物学读书笔记(5)

在一个简单的逆向反应中，通过加入PPi，催化错误插入的核糖核苷酸的去除。在第二种称为水解编辑（hydrolytic editing）的校对机制中，聚合酶倒退一个或更多的核苷酸并切开RNA产物，去除掉错误的序列。

11. 转录是由RNA序列内部的信号终止的：

答：称为终止子（terminator）的序列引发延伸聚合酶从DNA上脱离并且释放出它已经合成的RNA链。在细菌中，终止子有两种类型：Rho-非依赖型（Rho-independent）和Rho-依赖型（Rho-dependent）；第一种类型不需要其他因子的参与就可以引发聚合酶的终止反应（termination）；第二种类型，顾名思义，需要一个称为Rho的额外的蛋白质来诱发终止反应，我们将依次讨论者两种类型的终止子。

Rho-非依赖型终止子也称为固有终止子（intrinsic terminator），由两个序列元件组成：一段短的反向重复序列（大约20个核苷酸），其后是一段大约8个A：T碱基对的序列。

Rho是一个具有6个相同亚基的环状蛋白质，在单链RNA离开聚合酶时与之结合。此蛋白质还具有三磷酸腺苷水解酶（ATPase）的活性：一旦与转录物结合，它就利用ATP水解产生的能量将RNA从模板和聚合酶上拽下来。

首先，Rho结合的位点有某种特异性（所谓的rut位点，即Rho utilization）。特异性的第二层次是Rho无法与任何正在被翻译的转录物（也就是被核糖体结合的转录物）结合。 12. 真核生物的转录：

答：真核生物有三个不同的聚合酶（Pol Ⅰ、Pol Ⅱ和Pol Ⅲ），而细菌只有一个。还有，细菌只需要一个额外的起始因子（ζ），而真核生物中有效的和启动子特异的起始则需要几个起始因子。这些起始因子称为通用转录因子（general transcription factor，GTF）。

在体内，真核细胞内的DNA模板是整合在核小体内的。在这种环境下，通用转录因子就无法启动有意义的表达，而是需要额外的因子参与，包括所谓的“中介蛋白复合体”（mediator complex）和DNA结合调节蛋白，并常常包括染色质修饰酶。 13. RNA聚合酶Ⅱ的核心启动子是由4个不同序列的元件组合而成的：

答：真核细胞的核心启动子（core promoter）是指在体外检测时，Pol Ⅱ机器精确地起始转录所需要的最少的一组序列元件。在Pol Ⅱ核心启动子中发现的4个元件分别是TFⅡB识别元件（TFⅡB recognition element，BRE）、TATA元件（或盒子）、起始密码子（initiator，Inr）和下游启动子元件（downstream promoter element，DPE）。 在核心启动子之外（而且通常是在其上游）存在一些在体内进行有效转录所需的其他序列元件。这些元件包括：启动子最近元件（promoter proximal element），上游激活物序列（upstream activator sequence，UAS），增强子（enhancer），以及一系列的称为沉默子（silencer）、边界元件（boundary element）和绝缘子（insulator）的抑制元件。 14. RNA聚合酶Ⅱ在启动子上和通用转录因子形成前起始复合体： 答：许多Pol Ⅱ启动子包含一个所谓的TATA元件（大约在转录起始位点上游30个碱基对）这是前起始复合体开始形成的位置。TATA元件是由叫做TFⅡD的通用转录因子所识别的。TFⅡD中与TATA序列结合的成分称为TBP（TATA binding protein）。此复合体中的其他亚基称为TAF，即TBP关联因子（TBP-associated factor）。

形成的TBP-DNA复合体提供了一个平台，把其他通用转录因子和聚合酶本身招募到启动子上。在体外，这些蛋白质按照下列顺序在启动子处组装：TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF与聚合酶一起，然后是TFⅡE和TFⅡH，它们将结合在Pol Ⅱ上游。包含这些成分的前起始复合体形成后，启动子就开始解旋。与细菌中的情形相反，真核细胞中的启动子解旋需要ATP的水解并由TFⅡH介导，是该因子的类解旋酶活性刺激了启动子DNA的解开。

在真核细胞中，逃离启动子包含一个在细菌中所没有见到的步骤：聚合酶的磷酸化作用：Pol Ⅱ的大亚基有一个C端域（CTD），延伸成一个“尾巴”。CTD包含一连串重复的七肽

序列：Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。每一个重复序列都包含特定蛋白激酶的磷酸化位点，其中一个激酶就是TFⅡH的一个亚基。

15. TBP用一个插入双螺旋小沟的β折叠来结合并扭曲DNA：

答：TBP依赖TATA序列能够经受特殊的结构扭曲的能力而对其进行选择。 A：T碱基对是更有利的，因为它们更易于被扭曲而使小沟开始开放。 16. 其他通用转录因子在起始中也有特殊作用：

答：TAF：TBP与大约10个TAF相关。两个TAF在启动子处结合DNA元件，如起始密码子元件（Inr）和下游启动子元件（DPE）。几个TAF与组蛋白有结构同源性。另一个TAF似乎调节TBP与DNA的结合。

TFⅡB：此蛋白质为一条多肽单链，在TBP之后进入前起始复合体。特殊的TFⅡB-TBP和TFⅡB-DNA联系间的碱基特异性相互作用。TFⅡB在前起始复合体中也与Pol Ⅱ接触。因而，此蛋白质似乎是连接结合了TATA的TBP与聚合酶之间的桥梁。TFⅡB的N端域与细菌中ζ3.2相似的方式插入Pol Ⅱ的RNA出口通道。

TFⅡF：这个双亚基因子与Pol Ⅱ结合并与Pol Ⅱ（以及其他因子）一起被募集到启动子上。Pol Ⅱ与TFⅡF的结合起着稳定DNA-TBP-TFⅡB复合体的作用，并且是TFⅡE和TFⅡH被募集到前起始复合体上的前提条件。

TFⅡE和TFⅡH：TFⅡE与TFⅡF相似，由两个亚基构成，它是下一个结合到前起始复合体上的，并参与TFⅡH的募集以及调节。TFⅡH控制着依赖ATP的从前起始复合体向开放复合体的转变。TFⅡH内有两个亚基具有ATP酶的功能，还有一个亚基是蛋白激酶，参与启动子的解旋和逃离，与其他因子一起，ATP酶亚基还参与核苷酸错误匹配的修复。 17. 体内的转录起始需要其他蛋白质参与，包括中介蛋白复合体：

答：细胞内高水平的、受调节的转录还额外需要中介蛋白复合体和转录调节蛋白，并在很多情况下需要核小体修饰酶（其自身常常是大的蛋白质复合体的组成部分）。 18. 中介蛋白包含很多亚基，其中有些亚基从酵母到人类是保守的：

答：酵母和人的中介蛋白各自包括20个以上的亚基，其中7个在两种生物之间表现出显著的序列同源性。只有一个（Srb4）是几乎所有Pol Ⅱ基因在细胞内转录所必需的。

酵母和人类的中介蛋白都是由一些模块组装而成的。一个由Pol Ⅱ、中介蛋白和一些通用转录因子组成的复合体可以在DNA不存在的情况下座位一个单独的复合体从细胞中分离出来。预先形成的复合体被命名为RNA Pol Ⅱ全酶，也因而能够起始转录。 19. 一组新的因子激发Pol Ⅱ延伸和RNA校对：

答：一旦聚合酶起始了转录，便转入了延伸阶段。这一转变包括Pol Ⅱ酶脱落其大部分起始因子，如通用转录因子和中介蛋白。另一组因子被募集在它们的位置上。其中的一些（如TFⅡS和hSPT5）是延伸因子（elongation factor），也就是激发延伸的因子，其他的是RNA加工所需要的。

激酶P-TEFb，它是由转录激活因子募集到聚合酶上的。一旦与Pol Ⅱ结合，此蛋白质就将CTD重复序列中位置2处的丝氨酸残基磷酸化。P-TEFb磷酸化并因此激活另一个称为hSPT5的蛋白质。还有一个延伸因子，TAT-SF1，被P-TEFb募集。

另一个不影响起始但激发延伸的因子是TFⅡS。此因子促进延伸的总体速度，这是通过在遭遇到趋向于减缓聚合酶进程的序列时限制其暂停时间而实现的。

TFⅡS还有另外一个功能：它有助于由聚合酶进行的校对。

20. 延伸聚合酶与各种RNA加工所需要的一组新的蛋白质因子相互作用： 答：这些加工事件包括下面几个：RNA的5’端加帽（capping）、剪接（splicing）和RNA的3’端的多聚腺苷酸化（polyadenylation）。转录的延伸、终止和RNA加工似乎是相互联系的。

第一个RNA加工事件是加帽，即在RNA的5’端添加一个修饰过的鸟嘌呤碱基。加帽之后，尾部序列重复中的Ser5发生去磷酸化而导致加帽机器的脱离，而进一步的磷酸化（这次是尾部重复中的Ser2）又导致RNA剪接所需要的机器的募集。

最后一个RNA加工事件——mRNA 3’端的多聚腺苷酸化。正如加帽和剪接一样，聚合酶的CTD尾巴也参与募集多聚腺苷酸化所必需的酶。

有些序列一旦转录到RNA中，就会引发这些因子向RNA的转移，这些序列称为poly-A信号。一旦CPSF和CstF结合到RNA上，其他蛋白也就被募集，先引起RNA的切割，然后是多聚腺苷酸化。

已提出两个基本的模型来解释聚腺苷酸化合终止之间的联系：第一个是3’加工酶从聚合酶CTD尾巴到RNA的转移引发了聚合酶内的构象变化，降低了酶的前进能力，导致其后不久就自发终止。第二个模型提出，第二个RNA分子缺少5’端的帽子，这一点被聚合酶感知，因此识别其为不正确的转录物并终止。

21. RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ识别不同的启动子，使用不同组别的转录因子，但还是需要TBP： 答：rRNA基因的启动子包括两个部分：核心元件和UCE（上游控制元件，upstream control element）。除了Pol Ⅰ之外，起始还需要另外两个称为SL1和UBF的因子。

Pol Ⅲ启动子有各种形式，而且绝大部分具有位于转录起始位点下游的不寻常的特征。一些Pol Ⅲ启动子（如tRNA基因的启动子）包含两个区域，称为盒子A和盒子B，二者被一个短的元件分隔开；另一些包含盒子A和盒子C（如5SrRNA基因）；还有一些包含TATA元件，与Pol Ⅱ的启动子相似。

第13章 RNA剪接

知识点：

1. 几个基础概念：

答：许多真核基因是嵌合的：由一段编码区组成，它们被另外一段段非编码区隔开了。编码区称为外显子（exon），它们之间的非编码区称为内含子（intron）。

从pre-mRNA中除去内含子的过程称为RNA剪接（RNA splicing）。 可以除去不同组合的内含子，这称为可变剪接（alternative splicing）。通过这种方式，一个基因可以产生多个多肽产物。

2. RNA序列决定了在哪里进行剪接：

答：最保守的序列是内含子5’剪接位点的GU和3’剪接位点的AG及分支点的A。 3. 当内含子两边的外显子连接时，内含子是以套索结构被除去的：

答：剪接是由两步连续的转酯反应（transesterification）完成的，这样pre-mRNA中原来的一些磷酸二酯键断开，在形成一些新的磷酸二酯键。第一步转酯反应是由分支点保守腺苷酸的2’羟基引发的。它作为亲核基团，攻击5’剪接位点保守鸟苷酸的磷酰基团。结果，外显子3’端的核糖与内含子5’端磷酸之间的磷酸二酯键断开，而游离出来的5’磷酸与分支点保守腺苷酸的2’羟基连接。

在第二步转酯反应中，5’外显子（准确地说，是其新游离出来的3’羟基）反过来作为亲核基团，攻击3’剪接位点的磷酰基团。第二次转酯反应导致两个结果。首先，当然也是最重要的，是把5’和3’外显子连接起来了。其次，使内含子作为离去基团释放出去。 4. 不同的RNA分子的外显子可以通过反式剪接的方式连接起来： 5. RNA剪接是由一个叫做剪接体的大复合体执行的： 答：剪接体中的5种RNA（U1、U2、U4、U5和U6）统称为核内小RNA（small nuclear RNA，snRNA）。每种snRNA长100~300nt，与几种蛋白质形成复合物。这些RNA-蛋白质复合物

称作小核内核糖蛋白（small nuclear ribonuclear protein，snRNP）。剪接体就是由这些snRNP形成的巨型复合体，但是在剪接反应的不同时期具体的成分不尽相同：不同的snRNP在不同时间进出剪接体，每种snRNP执行某些专门的任务。剪接体中还有许多蛋白质不属于snRNP，另外一些蛋白质只能与剪接体松散结合。

snRNP在剪接中的功能有3个方面：识别5’剪接位点和分支点；按需要把这两个位点集结到一起；催化（或协助催化）RNA剪接和连接反应。 6. 剪接体内的组装、重排与催化反应：剪接过程：

答：首先，5’剪接位点被U1 snRNP识别（通过其snRNA与pre-mRNA之间的碱基配对）。U2AF的一个亚基与多聚嘧啶区结合，另一个亚基与3’剪接位点结合，前一个亚基与BBP相互作用，协助其结合到分支点上。以上形成的蛋白质和RNA结合体叫做早期（E）复合体。

随后，在U2AF协助下，U2 snRNP取代BBP结合到分支点，这样形成的结合物叫做A复合体。

下一步是A复合体通过重排把3个剪接位点拉到一起。这个步骤是通过U4、U6及U5 snRNP加入复合体而完成的。这3个snRNP合称三联snRNP（tri-snRNP）颗粒，其中U4和U6 snRNP通过其RNA组分的互补配对相结合，而U5 snRNP通过蛋白质相互作用松散结合。随着tri-snRNP颗粒的加入，A复合体就转变成B复合体。

再下一步，U1离开剪接体，其在5’剪接位点的位置由U6取代。这要求U1 snRNP与pre-mRNA之间的碱基配对断开，以便U6 RNA与同一区域配对（实际上时与一段与之重叠的序列配对），以上就是全部组装过程。后续的重排启动了催化反应，过程如下：U4离开剪接体，以便U6可以与U2发生作用（通过RNA-RNA配对）。重排后的剪接体叫C复合体，产生了活性位点，即重排把构成活性位点的所有组分聚集到剪接体内——据信只是U2和U6的RNA成分参与了催化反应。

活性位点出现后，就把pre-mRNA的5’剪接位点与分支点拉到了一起，加速了第一次转酯反应。5’和3’剪接位点的第二场转酯反应由U5 snRNP协助，把两个外显子连接在一起。最后的步骤是释放出mRNA产物及snRNP。

7. 自剪接内含子的存在表明RNA可以催化RNA剪接： 答： RNA剪接的3种类型

类型 细胞核pre-mRNA 丰度 很常见，适用于大多数真核基因 机制 两步转酯反应，分支点为A 与pre-mRNA相同 催化机器 主要剪接体 内含子编码的核酶 与Ⅱ类自剪接内含子相同 Ⅱ类自剪接内含子 罕见，来自某些细胞器的真核基因及原核基因 罕见，某些真核生物的细两步转酯反应，分支Ⅰ类自剪接内含子 胞核rRNA、细胞器基因，点为G 以及少量原核基因

8. Ⅰ类自剪接内含子释放出线形内含子，而不是一个套索结构：

答：Ⅰ类自剪接内含子剪接机制完全不同。它们使用游离的鸟苷或鸟苷酸，而不是分支点腺苷酸。RNA分子结合该鸟苷或鸟苷酸，并将其3’羟基呈递给5’剪接位点。以前面提到的形成套索结构的同类转酯反应，把游离的鸟苷或鸟苷酸与内含子5’端连接起来。第二步反应与以前讲述的完全相同：游离的外显子3’端攻击3’剪接位点。这个反应把两个外显子连接起来并释放出内含子，尽管在这里内含子是线形的，而不再是套索状。 Ⅰ类自剪接内含子比Ⅱ类小，有一个保守的二级结构。该结构包括一个容纳鸟苷或鸟苷

酸的结合口袋，只要这些鸟苷或鸟苷酸是以核糖的形式出现。除此之外，Ⅰ类自剪接内含子还含有一段“内在指导序列”，与5’剪接位点的序列配对，因而确定了鸟苷亲核攻击的精确位置。

9. 剪接体怎么可靠地确定剪接位点？

答：剪接位点的识别容易犯两种错误：一是遗漏了剪接位点，例如，结合到5’剪接位点的剪接体成分，跳过了正确的3’剪接位点，与结合到下游另一个3’剪接位点的剪接体成分配对。

二是与剪接位点邻近的非法位点被错认为剪接位点。

能够增加剪接位点选择准确性的两种机制如下。其一，在将某个基因转录为RNA时，RNA复制酶Ⅱ携带了多种具有RNA加工功能的蛋白质，其中包括参与剪接的蛋白质。当在新合成的RNA分子上遇到5’剪接位点时，那些蛋白质就从RNA复制酶Ⅱ的C端（剪接相关蛋白质搭乘在RNA复制酶Ⅱ的位置）转移到RNA分子上。剪接体成分一旦结合了5’剪接位点，就会做好准备与那些结合即将转录出来的、下一个3’剪接位点的剪接体成分相互作用。于是在更下游的任何竞争3’剪接位点被转录出来之前，剪接体成分就已经识别出了正确的3’剪接位点。

其二，确保优先识别邻近外显子的剪接位点（因而更有可能是真正的剪接位点），以防止使用错误剪接位点。一种叫做富含丝氨酸和精氨酸的蛋白质（SR蛋白）结合到外显子中的外显子剪接增强子（exonic splicing enhancer，ESE）。结合到这些位点的SR蛋白与剪接机器的组分相作用，将其引导到附近的剪接位点。这样剪接机器就可以更有效地结合到正确的剪接位点，而不会结合到离外显子较远的错误位点。 10. 通过可变剪接一个基因可以得到多个产物：

答：许多高等真核生物编码的RNA可以通过可变剪接，产生两条或多条不同的mRNA，从而翻译出不同的蛋白质。

可变剪接可以组成型的，也可以是受调控的。在前者，同一个基因总是产生多种不同的产物；在后者，不同的产物会在不同的时间、不同的条件，或在不同的细胞或组织类型中产生。

11. 可变剪接受激活因子和抑制因子的调控： 答：剪接调控蛋白结合到称为外显子/内含子剪接增强子（ESS或ISE，exonic/intronic splicing enhancer）或者外显子/内含子剪接减弱子（ESS或ISS，exonic/intronic splicing silencer，ISS）的特殊序列上。前者增强附近的剪接位点的剪接，后者正好相反。

SR蛋白利用某个结构域结合RNA，如熟知的RNA识别基序（RNA-recognition motif，RRM）。每个SR蛋白都含有另一个结构域，富含精氨酸和丝氨酸，称为RS结构域（RS domain）。该结构域位于肽链的C端，介导SR蛋白与剪接体蛋白的相互作用，以便把剪接体募集到附近的剪接位点。

多数减弱子由不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族的成员识别，这些蛋白质能结合RNA但没有RS结构域，所以无法募集剪接体，相反它们可以阻断特定的剪接位点，使之丧失作用。

我们曾强调过可变剪接作为从同一个基因得到多种不同的蛋白质产物的一种途径，这些不同的蛋白质叫做同工型（isoform）。它们可能具有相似或不同的功能，甚至作用相拮抗（一种同工型可能对另一种具有显性的负作用）。甚至有些基因虽然只编码一种功能蛋白，但也存在可变剪接现象。这时可变剪接仅是对该基因的表达起到开关的作用。 12. 少数内含子是由另一组snRNP组成的另一种剪接体来剪接的： 答：低丰度剪接体识别一类很少见的内含子，其共有序列不同于绝大多数pre-mRNA内含子的共有序列。这种新发现的低丰度剪接体称为AT-AC剪接体，因为最初发现其识别的罕见

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