基因的分子生物学读书笔记(2)

12. 组蛋白的N端尾可稳定盘绕在八聚体上的DNA。 13. 染色质的高级结构：

答：组蛋白H1与核小体间的连接DNA结合。

核小体束能形成更复杂的结构：30nm的纤丝。 DNA的进一步压缩涉及到核小体DNA的大环。 组蛋白的变构体影响核小体功能。

14. DNA与组蛋白八聚体的相互作用是一动态的过程。 15. 核小体重塑复合体有助于核小体的移动：

答：组蛋白八聚体与DNA相互作用的稳定性受到大的蛋白复合体——核小体重塑复合体（nucleosome remodeling complex）的影响。这些多蛋白复合体利用ATP水解释放的能量，便于核小体改变位置或与DNA相互作用。这些变化有3中方式：①组蛋白八聚体沿DNA“滑动”（sliding）；②组蛋白八聚体从一个DNA分子到另一DNA分子的完全“转移”（transfer）；③核小体“重塑”（remodeling），增加DNA的易接近性。 16. 某些核小体在体内处于特定的位置：核小体的定位： 答：由于核小体与DNA的动态相互作用，大多数核小体的位置是不固定的。但在有些情况，对核小体的位置，或称为核小体的定位（positioning），进行限制是有利的。 17. 组蛋白N端尾的修饰可改变染色质的易接近性：

答：当组蛋白从细胞中分离出来，其N端尾通常被许多种小分子修饰。在尾部的赖氨酸经常被乙酰基或甲基修饰，而丝氨酸主要受磷酸化修饰。一般来说，乙酰化的核小体与染色体上转录活跃的区域结合，而脱乙酰化的核小体与染色质上转录受抑制的区域结合。与乙酰化不同，N端尾不同部位上的甲基化使核小体可以与抑制的和活化的染色质都能结合，这取决于组蛋白尾上被修饰的特定的氨基酸。 18. DNA复制后核小体立即被组装：

答：当复制叉经过时，核小体解体为亚组装部件。H3·H4四聚体似乎仍随机地与两个子代双螺旋之一结合，并不从DNA上释放而成为游离的成分。相反，H2A·H2B二聚体被释放且进入局部的环境，参与新的核小体的组装。 19. 核小体的组装需要组蛋白“伴侣”：

答：在生理盐浓度下对核小体组装的研究鉴定出一些能指导组蛋白在DNA上组装的因子。这些因子是带负电荷的蛋白质，与H3·H4四聚体或H2A·H2B二聚体形成复合体，并护送它们到核小体组装的位点。由于这些因子可以避免组蛋白与DNA发生无效的相互作用，因此被称为组蛋白伴侣（histone chaperone）。

PCNA形成一个环绕着DNA双螺旋的环，在DNA合成过程中将DNA聚合酶固定在DNA上。当聚合酶作用完成后，PCNA由DNA聚合酶上释放，但仍与DNA相连。在这种情况下，PCNA能与其他蛋白质发生作用。CAF-1与释放的PCNA结合，优先将H3·H4四聚体组装到与PCNA结合的DNA上。 20. 简述染色体的组装过程。

答：在DNA的复制过程中，核小体暂时解体，组蛋白H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体被随机分配到任一子代分子中，在DNA复制后，核小体立即被组装，这涉及到特定的组蛋白伴侣的功能，这些组蛋白伴侣护送H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体到达复制叉。随后，在旧蛋白的“种子”作用下，发生相似修饰，一旦DNA包装成核小体，它有能力借助组蛋白的H1来进行进一步压缩DNA，开成染色质形式（30nm纤丝），在细胞分裂间期，染色质进一步浓缩成染色体。

第8章 DNA的复制

知识点：

1. DNA合成的化学基础：

答：DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头。

DNA通过引物3’端的延伸进行合成。 焦磷酸水解是DNA合成的驱动力。 2. DNA聚合酶的作用机制： 答：（1）DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的合成：DNA聚合酶催化核苷酸添加需要正确配对的碱基，空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP。 （2）DNA聚合酶像手一样握住引物：模板接头。

聚合酶的3个结构域被称为拇指、手指和手掌。

手掌域由一个β折叠片构成，含有催化位点的基本元件，尤其是DNA聚合酶的这一区域结合2个二价金属离子（镁离子和锌离子），可以改变正确剪辑配对的dNTP和引物3’-OH周围的化学环境。除了催化作用外，手掌域还负责检查最新加入的核苷酸碱基配对的准确性。

功能：1）有两个催化位点，一个延长链，别一个是把错误的dNTP排除掉，起校对功能；

2）聚合位点有两个金属离子，它们有利于催化的进行； 3）检测配对的准确性。

手指域中的几个残基可与引入的dNTP结合。一旦引入的dNTP与模板之间形成正确的碱基配对，手指域即发生移动，包围住dNTP。

功能：1）结合运进来的dNTP，并带到正确的位子； 2）弯曲模板，让模板碱基与dNTP正确配对； 3）稳定PPi的功能。

拇指域与催化的关联不紧密，而是与最新近合成的DNA相互作用。还有两个目的：第一，维持引物以及活性部位的正确位置；第二，帮助维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接。

功能：不直接参与催化，但是可保持引物和活性位点处在正确的位置，还可帮助维持DNA聚合酶与其底物紧密连接，有助于添加许多dNTP的能力。 （3）DNA聚合酶是一种延伸酶：

DNA聚合酶的催化是快速的。DNA聚合酶能在引物链上每秒添加1000个核苷酸。DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力。延伸能力（processivity）是酶处理多聚体底物时的一种特性。对于DNA聚合酶，其延伸能力定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数。

（4）外切核酸酶校正新合成出的DNA：

DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸实现的。最初这种类型的酶被认作是DNA聚合酶的同一类多肽，现在则称为校正外切核酸酶（proofreading exonuclease）。这类酶可以从DNA的3’端，即从新DNA链的生长端开始降解DNA。 3. 复制叉上DNA的两条链同时合成：

答：刚分开的模板链与未复制的双链DNA之间的连接区称为复制叉（replication fork），复制叉向着未复制的DNA双链区域连续运动，其身后留下指导两个子代DNA双链形成的两条单链DNA模板。

在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉。此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（leading strand）。

另一条单链DNA模板指导下的新DNA链合成遇到的问题较多，此模板指导DNA聚合酶在与复制叉相反的方向上运动。此模板指导的新DNA链称为后随链（lagging strand）。

在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment），其在细菌中的长度变化为1000~2000个核苷酸，在真核生物中为100~400个核苷酸。 4. DNA新链的起始需要一条RNA引物：

答：引物酶（primase）是一种能在单链DNA模板上制造短RNA引物（5~10个核苷酸长度）的特殊的RNA聚合酶。

5. 完成DNA复制必须除去RNA引物：

答：为了用DNA取代RNA引物，RNA酶H（RNase H）识别并除去各条RNA引物的大部分。

最后一个核糖核苷酸是由从5’端降解RNA或DNA的外切核酸酶除去的。 DNA上的“切口”被称为DNA连接酶（DNA ligase）的酶修复。 6. DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋：

答：DNA聚合酶解离双链DNA的两条碱基配对链的能力很差。因此，在复制叉上，由称为DNA解旋酶（DNA helicase）的另一组酶催化双链DNA两条链的分离。

每个DNA解旋酶在单链DNA上都沿着一定的方向运动。这是所有DNA解旋酶都具有的特性，称作极性（polarity）。

7. 复制前单链结合蛋白使单链DNA稳定：

答：一个SSB的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链DNA结合。这称为协同结合（cooperative binding），其发生是因为与紧邻的单链DNA区域结合SSB分子之间也能够结合。

8. 拓扑异构酶除去DNA解螺旋时在复制叉上产生的超螺旋。 9. 复制叉酶扩大了DNA聚合酶底物的范围。

10. 细胞中DNA聚合酶为行使不同的功能而被特化：

答：E. coli中至少有5种DNA聚合酶，这些酶依据其酶学特性、亚基组成和丰度而划分。DNA聚合酶Ⅲ（DNA Pol Ⅲ）是染色体复制中所涉及的最主要的酶。

DNA聚合酶Ⅰ（DNA Pol Ⅰ）专门用于除去起始DNA合成所需的RNA引物。 E. coli中的另外3种DNA聚合酶特别用于DNA的修复，它们无校正活性。

真核细胞中也有多种DNA聚合酶，通常细胞中有15种以上。其中，对于基因组的复制至关重要的有3种：DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε以及DNA聚合酶α/引物酶。

引物酶合成RNA引物后，所产生的RNA引物-模板接头立即与DNA聚合酶α结合以启动DNA的合成。

因为DNA Pol α/引物酶的延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代。聚合酶δ或聚合酶ε取代DNA Pol α/引物酶的过程称作聚合酶的切换（polymerase switching），这导致在真核细胞复制叉上有3种不同的DNA聚合酶在工作。如同在细菌细胞中那样，真核细胞中其他的DNA聚合酶大多参与DNA的修复。 11. 滑动夹极大地增加了DNA聚合酶的延伸能力：

答：DNA聚合酶在复制叉上具有高延伸能力的关键原因在于它们与被称为滑动DNA夹（sliding DNA clamp）的蛋白质间的结合。

12. 滑动夹通过滑动夹装载器打开并安置在DNA上：

答：一类称为滑动夹装载器（sliding clamp loader）的特殊的蛋白复合体催化滑动夹的打开并将其安放在DNA上。这些酶通过结合ATP并将其水解而将滑动夹置于DNA的引物-模板接头上。

13. 复制叉上的DNA合成： 答：E. coli中，这些聚合酶的协同作用是通过它们连接成一个巨大的多蛋白复合体而实现的。此复合体被称为DNA聚合酶Ⅲ全酶。全酶是对一个具有核心酶并结合有增强其功能的其他

元件的多蛋白复合体的总称。

当解旋酶在复制叉处解开DNA螺旋时，前导链被迅速地复制，同时后随链以单链DNA的形式伸出，并被SSB迅速地结合。新RNA引物在后随链模板上进行不连续的合成。当后随链上的DNA聚合酶完成前面的冈崎片段时，即从模板上释放出来。因为这个聚合酶与前导链上的DNA聚合酶保持着连接，所以它将与距复制叉最近的并且由后随链上最新合成出的RNA引物所形成的引物-模板接头结合。通过与此RNA引物的结合，后随链上的聚合酶形成一个新的环并启动下一轮冈崎片段的合成。这个模型被称作“长号模型”，以比喻由后随链模板所形成的DNA环状结构大小的变化。

14. 复制叉蛋白之间的相互作用形成E. coli的复制体:

答：DNA解旋酶与DNA聚合酶Ⅲ全酶之间的相互作用。这个由全酶的夹子装载器元件介导的相互作用将解旋酶和DNA聚合酶Ⅲ全酶连到一起。

DNA解旋酶与引物酶之间，在约1秒一次的间隔中，引物酶与解旋酶以及SSB覆盖的单链DNA结合并合成新的RNA引物。

复制叉上作用的全部蛋白质的总和称为复制体（replisome）。

15. DNA解旋和复制起始发生的特殊位点称作复制起始位点（origin of replication）。 16. 复制起始的复制子模型：

答：定义所有的DNA均从称为复制子（replicon）的特定的起始位点开始复制。

复制子模型提出了控制复制起始的两个元件：复制器和起始子。复制器（replicator）是指足够指导DNA复制起始的整套顺式作用的DNA序列。

复制子模型的第二个元件是起始子（initiator）蛋白。此蛋白质特异性地识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始。

17. 复制器序列包括起始子结合位点和容易解旋的DNA：

答：复制器的DNA序列有2个共同的特性。第一，它们含有起始子蛋白质结合位点，此位点是组装复制起始机器的核心；第二，它们含有一段富含AT的DNA，此段DNA容易解旋但并不自发进行。

18. 结合和解旋：起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活：

答：起始子蛋白在复制起始过程中一般执行3种不同的功能。第一，这些蛋白质与复制器中的特异DNA序列结合；第二，一旦与DNA结合，它们就扭曲或解旋其结合位点附近的DNA区域；第三，起始子蛋白与复制起始所需的其他因子相互作用，使它们聚集到复制器上。

以E. coli起始子蛋白DnaA为例。DnaA与oriC中重复的9核苷酸单位元件结合并受ATP的调控。

DnaA还会在复制器所形成的单链DNA上聚集其他的包括DNA解旋酶的复制蛋白。 真核细胞中，起始子时一个被称为起始位点识别复合体（origin recognition complex，ORC）的六蛋白复合体。ORC可识别酵母复制器上称为A元件的保守序列，以及次保守的B1元件。ORC可将其他复制蛋白全部召集到复制器上。所以，ORC具有起始子三项常见功能中的两项：与复制子结合并将其他复制蛋白召集到复制器上。 19. 蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用指导起始过程：

答：起始子（DnaA）结合到oriC并使13核苷酸单位的DNA解旋后，单链DNA和DnaA共同召集双蛋白复合体：DNA解旋酶、DnaB以及解旋酶装载器DnaC。

解旋酶与上面所说的复制叉其他元件之间的蛋白质相互作用指导复制机器其他部分的组装。

20. 前复制复合体的形成指导真核细胞中的复制起始：

答：复制器选择是对指导复制起始的序列进行识别的过程，发生于G1期（早于S期）。此过程导致基因组中每个复制器上都组装一个多蛋白复合体。起始位点激活只在细胞进入S期

后发生，使复制器结合的蛋白复合体启动DNA的解旋和DNA聚合酶的募集。

复制器选择是由前复制复合体（pre-RC）的形成介导的。

pre-RC被两种蛋白激酶（Cdk和Ddk）激活，使复制得以启动。所有的激酶都在G1期失活，只有在细胞进入S期以后才能被激活。

21. 对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期中仅有一轮复制发生：

答：Cdk对于pre-RC功能的调控有两个似乎矛盾的作用：第一，它们是激活pre-RC以启动DNA复制所必需的；第二，Cdk的活性会抑制新pre-RC的形成。

在G1期内没有有活性的Cdk，但是细胞周期的其他期内（S、G2和M期）一直存在高水平的Cdk。因此，在每个细胞周期内，pre-RC仅仅有一次形成的机会（G1期内），而且这些pre-RC被激活的机会也仅有一次（在S、G2和M期虽然实际上所有的pre-RC都被S期的复制叉激活或破坏）。

22. 子代DNA分子的分离需要拓扑异构酶Ⅱ。 23. 后随链的合成不能复制线性染色体的最末端：

答：所有新的DNA合成启动都需要一条RNA引物，这使线性染色体末端的复制成为难题。这种情况被称为末端复制问题（end replication problem）。

细胞解决末端复制问题有各种各样的方法。一种解决方法是用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物。

多数真核细胞使用完全不同的方法来复制其染色体末端。真核生物染色体的末端称为端粒，它们通常由首尾相连的富含TG的重复DNA序列构成。这种独特的结构可作为新的复制起始位点以弥补末端复制问题。

24. 端粒酶是一种新型的DNA聚合酶，它不需要外源模板：

答：端粒酶是一种特殊的酶，它既含有蛋白质成分也含有RNA成分（所以这是一个核糖核蛋白的例子）。与其他所有DNA聚合酶相同的是，端粒酶用于延伸其DNA底物的3’端。但与大多数DNA聚合酶不同的是，端粒酶不需要外源性DNA模板来指导新dNTP的添加，而是利用其RNA成分作为模板，将端粒序列添加到染色体末端的3’端。端粒酶利用其自身的RNA作为模板，特异性地延伸特定单链DNA序列的3’-OH。新合成的DNA为单链DNA。

25. 为什么真核生物染色体在一个周期中只能复制一次？

答：真核细胞分裂所需的事件发生在细胞周期的不同时期。染色体DNA复制仅发生在细胞周期的S期。在此期间，细胞中的所有DNA都必须精确地复制一次。染色体任何部分复制的不完整都可造成染色体之间不适当的连接。互联染色体的分离会引起染色体的断裂或缺失。DNA的重复制也会造成严重后果，使基因组中特殊区域的拷贝数增加。重要调控基因的拷贝数即使增加一个或两个也会导致基因表达、细胞分裂或对环境信号应答的灾难性缺陷。所以，真核细胞每分裂一次，每条染色体中每个碱基对复制且只能复制一次，使极其重要的。

26. 端粒酶如何实现端粒的复制？ 答：端粒酶用其RNA成分与端粒单链DNA区域的3`端退火，随后用其反转录活性合成DNA至RNA模板末端。这时端粒酶将RNA从DNA产物上移去，并重新结合到端粒的末端，重复上面的过程。

第9章 DNA的突变和修复

知识点：

1.突变的本质：

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