(2)容量瓶(1000ml、250ml) (3)比色管(50ml)
(4)吸量管(5ml、10ml) (5)苯酚(AR)
准确称取苯酚0.010g于200ml蒸馏水中,溶解后定量转移到1000ml的容量瓶中,作为储备液。
于5支50ml的比色管中,用吸量管分别加入0.5 ml、2ml、5ml、10ml、20ml的10ug/ml苯酚标准溶液,用蒸馏水定容至刻度,摇匀。
3.实验原理
苯酚是一种剧毒物质,可以致癌,已经被列入有机污染物的黑名单。但在一些药品、食品添加剂、消毒液等产品中均含有一定量的苯酚。如果其含量超标,就会产生很大的毒害作用。苯酚在紫外光区的最大吸收波长λmax=270nm。对苯酚溶液进行扫描时,在270nm处有较强的吸收峰。
定性分析时,可在同一条件下,对标准样品和未知样品进行波长扫描,通过比较两者光谱图样进行鉴定。在没有标准样品的情况下,可与标准谱图进行比较。
定量分析是在270nm处,通过测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值绘制标准曲线。再在此条件下测定未知样品的吸光度,从标准曲线中得出未知样中的含量。
4.实验数据处理
(1)最大吸收波长的选择
在标准系列溶液中任取一种,以水为参比,分别在波长200~300nm之间以10为间隔测定其吸收波长,在吸光度最大值附近以间隔2为单位测定,直至找到最大吸收波长。
(2)标准曲线绘制
在已筛选的最大波长下,以水为参比分别测定上述标准溶液的吸光度,画出C-A曲线,写出回归曲线方程。
(3)苯酚浓度的测定
在相同情况下,测定其吸光度。根据回归曲线方程计算出待测苯酚浓度。
5.问题讨论
(1)紫外可见分光光度法的定性、定量分析的依据是什么? (2)紫外可见分光光度计的主要组成部件有哪些? (3)说明紫外可见分光光度法的特点及适用范围。
13.7.4 实验四 使用积分球测定阻燃布样品的镜反射和漫反射光谱
1.实验目的和要求
紫外可见分光光度计广泛应用于化学、材料、光学和生命科学等测试领域。积分球是紫 外可见分光光度计最为重要的附属装置,由于积分球的使用,大大扩展了光度计可以测定的样品形态和种类,比如悬浊样品和不透明类样品。本实验以实际测定为例,介绍了样品镜面反射和漫反射光谱以及色度的测定方法。
2.实验原理
当光线照射到样品上时,一部分光在样品表面产生镜面反射,该光线反射角等于入射角, 满足反射定律,另一部分光经折射进入样品内部经样品折射、散射和吸收后,最后光线
由样品表面辐射出来,这部分光由于散向各方而称为漫反射。如图13-17所示
图 13-17 镜面反射和漫反射
积分球又称为光通球,是中空的完整球壳。内壁涂白色漫反射层,反射层通常是 BaSO4 或聚四氟乙烯,要求球内壁涂层涂敷均匀。图13-18是积分球的原理图。
图 13-18 积分球的原理图
3.实验内容
1)薄凹凸透镜的漫反射和镜面反射测定 a.、漫反射测定。
样品凹面涂黑,测定凸面的漫反射光谱,两块标准 BaSO4 白板校正仪器基线,样品放积分球0o侧,以BaSO4白板做参比,如图13-19 所示放置样品。得样品的漫反射光谱,如图中下面的曲线。
图 13-19 漫反射测定示意图
b、 镜面反射测定。
使用 S/R 切换功能,切换分光光度计的样品和参比光束,标准铝镜放积分球8o入射侧,BaSO4 白板放参比侧,校正仪器基线。然后用样品取代铝镜,如图13.20所示放置样品得镜面反射光谱,如图 13-21 中上面的曲线
图 13-20 镜面反射测定示意图
图 13-21 凹凸透镜的漫反射和镜面反射光谱
2)阻燃伪装布光谱性能测试
纺织品的光谱特性是积分球很典型的测试项目,本例通过积分球测定伪装布表面各斑点颜色的光谱性能。 该样品表面由灰、 绿、 棕和黑4种颜色斑点组成, 剪裁每种颜色斑点15mm×25mm大小,放置样品于积分球0o侧,测定各颜色斑点的反射光谱,如图 13-22所示。
图 13-22 各颜色斑点的反射光谱图
4.使用积分球附件的注意事项:
(1)无论使用透过样品还是反射样品,都要使样品紧密贴紧积分球开口,如有间隙会使测量值产生误差;
(2)如副白板表面被污染,可用细砂纸轻轻磨干净,并将副白板保存在干燥的容器中;(3)测试粉末样品时,禁止倒置以将粉末或粉尘弄入积分球内; (4)不能用手触摸镜面;
(5)当积分球不使用时,把积分球和反射筒(reflector)放回附件箱内;
(6)清洁事项:对于镜片,用干燥清洁的压缩空气或氮气清洁;对于涂层表面,先用干燥清洁的压缩空气清洁,接着用蒸馏水洗净,再用压缩空气干燥;对于附上的灰尘,用细度为220—240目的砂纸除去,再用蒸馏水洗净,最后用压缩空气干燥。
5.思考题
(1)积分球如何安装和使用?
(2)积分球安装和使用过程中那些因素可以产生实验误差,如何消除? 13.7.5 实验五 三波长光度法测定植物中总黄酮含量
1.实验目的和要求
(1)了解三波长分光光度法的测定原理。 (2)掌握总黄酮含量的测定方法。 2.实验仪器和试剂
仪器:
(1)紫外可见分光光度计(波长扫描范围在200~600nm)1套。 (2)超声波清洗器。 试剂:
芦丁标准品溶液:称取105℃干燥至恒重的芦丁(中国药品生物制品检定所)20.30mg,用70% 乙醇溶解定容至100mL。
70%乙醇。 1%三氯化铝。 石英砂。
植物叶和果:洗净,自然干燥后加石英砂充分研磨备用。 HCl-Mg溶液、AlCl3溶液、Pb(Ac)3溶液。
2mL带刻度移液管1支,10mL容量瓶7个,100mL容量瓶若干,带塞玻璃瓶若干。
3.实验原理
1)总黄酮含量的测定原理
黄酮类化合物主要是在紫外吸收光谱带I(300~400nm)和带II(240~280nm)范围内吸收。而植物果和叶中含有的其他成分刚好在带I和带II内有一定程度相同的吸收,这对总黄酮的含量测定会产生干扰,因此通常选择铝配合物显色体系来测定样品中总黄酮的含量。这是因为铝盐可以和黄酮类化合物形成稳定的化合物,使吸收带I产生明显红移,大大增加了吸光度。
2)测定的基本原理
采用三波长分光光度法测定黄酮类化合物的基本原理如图 13-23 所示。
图13-23 三波长光度法原理示意图 1- 待测成分; 2- 混浊; 3 - 1 + 2
图13.24 三波长光度法消除干扰示意图
由于三角形λ1Nλ2 和λ1 Pλ3 相似,故任一吸收曲线上,任意选择3个波长λ1、λ2 和λ3 ,测定的吸光度为A1、A2 和A3:
?A?Q?2?(N?2?MN)
∵ △Rλ1 P≌△MNP
∴ 测定的A1、A2 和A3 具有下列函数关系:
mA1?nA3(?2??3)A1?(?1??2)A3??2m??1?n??3?A?A2??A2??????m?n?1??3m?n?????c?L?
式中: L -光程,m- 波长λ2 和λ3 的差值, n- 波长λ1 和λ2的差值,c为待测物的摩尔浓度,ελ、ελ、和ελ分别为待测物在3个波长处的摩尔吸光系数。因 ΔA值与待测物浓度成正比,而用于待测物浓度的测定。
由图13.23可以看出,当ΔA值为零时,所选3个波长处,测得的相应吸收光谱上3点在一条直线上。因此,任选3个波长测定,使干扰成分产生的吸收光谱为一条直线,这样测得的
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