微生物实验指导书(1)(5)

3、 分离培养: 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

4 、证实试验:在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

5 、 报告: 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。6、 粪大肠菌群(faecal coliform) 6.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。

6.2 结果报告: 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

实验十三、 食品中细菌总数的测定

一、实验目的：

1、 学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。 二、实验原理：

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验 材料： 3.1 食品检样

3.2 培养基 :营养琼脂培养基，无菌生理盐水

3.3 其它 ;无菌培养皿，无菌移液管，无菌不锈钢勺。

四、 流程：检样→ 做成几个适当倍数的稀释液→ 选择2～3个适当倍数的稀释液各以1ml分别加入灭菌平皿内→每皿内加入适量营养

琼脂→ 菌落计数→报告 五、操作 步骤：

1、 取样、稀释和培养

1.1 以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。

1.2 用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。 1.3 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。

1.4 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

1.5 稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 1.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算

平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

2、 菌落计数方法 作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。 3、 菌落计数报告方法 3.1 平皿菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。 3.2 稀释度的选择

3.2.1 应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告： 稀释度选择及菌落数报告方式

例稀释液及菌落数 10次 10-1 10-2 -3 1 多不可164 20 计 2 多不可295 46 计 3 多不可271 60 计 4 多不可多不31计 可计 3 5 27 11 5 6 7 0 两稀释液 之比 - 1.6 2.2 - - 菌落总数 (个/g或ml) 16400 37750 27100 31300 270 报告方式 (个/g或ml) 16000或1.6×104 38000或3.8×104 27000或2.7×104 31000或3.1×104 270或2.7×102 ＜10 31000或3.1×104 0 0 - ＜1×10 30500 多不可305 12 - 计 .3.2.2 若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值≤2取平均数，比值>2则其较小数字（表1中例2和3）。

3.2.3 若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1中例4）。

3.2.4若所有稀释度均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之（表1中例5）。

3.2.5若所有稀释度均无菌落生长，则应按<1乘以最低稀释倍数报告之（表1中例6）。

3.2.6若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表1中例7）。

3.4 菌落计数报告方法

菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。 4、 结果

1 将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。 2 对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。

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