微生物实验指导书(1)(3)

一、目的要求1、明确培养基的配制原理。2、通过对米曲汁培养基和细菌培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 二、基本原理

米曲汁培养基和牛肉膏蛋白胨培养基是两种应用最广泛和最普通的霉菌及细菌培养基，米曲汁培养基为微生物生长提供大量的碳源和能源等。细菌培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源氮源，而NaCI提供无机盐。在配制培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下960C时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在400C时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。另外细菌培养基，要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 三、器材

大米，牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，；1mol/L NaOH, 1mol/L HCI；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平牛角匙，高压灭菌锅，铝锅、pH试纸（pH5.5-9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，纱布等。 四、操作步骤

1．米曲汁培养基（8人一组，每人5支-6支）

（1）大米300g淘洗干净加入（1：4）的水2.5斤熬煮成米粒松散的粥（2）加入大米重量15%的麸曲40g搅拌均匀。（3）加入50单位/g的糖化酶约1g搅拌均匀。（4）放置于60-610C培养2-3h。（5）过滤不足时用蔗糖调整（滤液（7-7.5B0t）。（滤液波美度太高时加水调节：VH2O=ΔB0e/7.5B0e，如果滤液波美度达不到所需值，应加热浓缩。）（6）向滤液中加入2%琼脂加热熔解（米曲汁量）（7）分装试管，塞棉塞、捆扎。（8）灭菌。（9）摆斜面。（10）培养基检验:① 500g×50单位/g÷ 5万 =1.5g(大米重量) (糖化酶活力)② 将培养基在300C的条件下培养2-3天，观察是否染杂菌。

2、细菌培养基制备：（2人一组，每人做5支，配制100ml）

(1) 蛋白胨1g, 牛肉膏0.3g(3%的牛肉膏溶液10ml) NaCI 0.5g 琼脂2g 水 100ml(注:牛肉膏事先配成3%溶液待用)(2) 用10%Na2CO3条pH至7.2-7.4(或用NaOH) (3) 加入琼脂加热搅拌溶解.(4) 分装试管，塞棉塞、捆扎。(5) 灭菌。（6）摆斜面。(7)培养基检验:50ml水+蛋白胨1g→+10ml牛肉膏+0.5gNaCI+40ml水+2g琼脂

3.淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基,培养放线菌) 可溶性淀粉 20g 2g KNO3 1g 0.1g K2HPO4 0.5g 0.05g NaCI 0.5g 0.05g MgSO4 0.5g 0.05g FeSO4 0.01g 0.001g 琼脂 20g 2g 水 1000ml 100ml pH 7.2-7.4 7.2-7.4 （注意：分五组，7人一组，每人4支）

配制时，先用少量水，将淀粉调成糊状，在火上加热边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml（或100ml）。1.05Kg/Cm2,121.30C灭菌20分钟。 五、实验报告 六、总结：

1．这次实验学生试管培养基制备数：每人5-6支。 其中：细菌2支，酵母菌2支，霉菌2支，淀粉培养基1支

用途：练习接种：细菌2支，酵母菌2支，霉菌1支，淀粉培养

基1支。考试：细菌1支，酵母菌或霉菌1支。 2． 实验注意事项：

（1）配料要准确、严格。（2）琼脂量指米霉菌汁（滤液）量的2%（不能过少）。（3）消毒压力一定要达到0.1帕30min. (4) 等斜面凉透后再捆扎收藏备用. (5)检验pH的时间.

实验九微生物的接种

一、 实验目的要求：

1、 掌握无菌操作的基本环节。2、在规定的时间内完成一定数量的接种任务。 二、 实验材料：

1、 菌种：①细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌②酵母菌：面包酵母③霉菌：米曲霉、黑曲霉 2、 基质：①细菌基质 ②糖液

3、 接种工具：接种环、酒精灯、接种箱等 4、 其它

三、 实验原理：

接种中始终保持无菌操作，所用器具必须灭菌，接种前后接种针要灭菌，在火焰周围接种，棉塞也要灭菌。 四、 操作：

1、 接种前准备：

查接种工具，贴标签：菌名、姓名、日期（代数） 2、接种方法：

（1）拿试管（2）点酒精灯（3）接种针灭菌（4）接种（5）试管口灭菌、棉塞灭菌（6）重塞棉塞（7）接种针灭菌 3、注意事项：（1）勿划破基质表面（2）菌体勿沾到管壁上（3）菌体勿烫死

实验十、空气中微生物的检验

一、目的要求

1、通过实验了解一定环境中微生物的分布状况。2、学习并掌握空气中微生物检验的基本方法。3、学会沉降平板法测定空气中微生物含量的方法。

二、基本原理:空气中含有多种微生物，当落到适宜的环境条件下如：营养、酸碱度、氧等，再在适宜的温度条件下进行培养，就会良好生长。 三、实验仪器

粗天平、 培养皿、 150ml三角瓶、 烧杯、 吸耳球、10ml吸管、 高压灭菌锅 四、操作步骤

（一）、平板配方（每组配70ml）

蛋白胨1% 牛肉膏0.3% NaCl0.5% 琼脂1.5% 葡萄糖0.1% PH7-7.2

（二）、培养基配制、灭菌、制平板：

1、配制：用100ml烧杯在天平上称取牛肉膏0.2g,然后再用纸片分别称取蛋白胨0.7g, NaCl 0.35g放入烧杯中，再吸取1%葡萄糖7ml，加入少量水（约30ml）溶解后用1M NaOH调PH至7.0-7.2，然后倒入100ml量筒中加水至70ml用漏斗倒入150ml三角瓶中再加入1-1.5g琼脂，塞入棉塞用纸包好灭菌。

2、器皿准备：①每组将直径90mm的培养皿6个刷洗干净分2包用纸包好待灭菌。②每组分别将一支10ml吸管和一个吸耳球用纸包好待灭菌。

3、灭菌：将上述培养基和器皿放入高压灭菌锅内控制蒸汽压力0.1MPa至0.12MPa灭菌15min，缓慢排气冷却。

4、制平板：当灭菌器压力回零后，打开盖趁热取出放入接种箱内，在无菌条件下，先将三角瓶内培养基晃匀趁热用10ml吸管吸取10ml培养基放入培养皿内晃平后放入水平位置冷却凝固。 （三）、使空气中的微生物自然落入培养皿的培养基上，将冷却凝固后的平板培养基包好带入被检测场所，将平皿（5个）均匀摆在被测场所的离地面高0.8m以上的平面上（防止将地面的尘土吸起落入皿内）

将平皿打开，估计空气中菌的浓度多少，使平板培养基暴露在空气中待一定时间（6-60min）然后将培养皿盖好。培养1-2天。 该次安排各组被测场所及暴露时间如下： 1-2组 检测接种箱内空气 60分钟 3-4组 检测接种箱内空气 30分钟 5-6组 微生物实验室内空气 5分钟 7-8组 教室内空气 5分钟 9-10组 卫生间空气 5分钟 11-12组 实习厂空气 1分钟

注意：（每组6个平板培养基，其中5个做实验，1个做无菌空白对照） （四）培养：

将培养皿包好倒扣在350C培养箱内培养3天观察记录平皿内的菌落数，取5个平皿的平均值计称。 （五）、计称：

1、 计称5个平皿的平均菌落数 平皿平均数=（皿1+皿2+……+皿5）/5 2、计称100cm2培养基暴露10分钟时的菌落数

100cm2培养基10分钟菌落数=平皿平均数/r2πt×10×100 平皿平均数---5个平皿平均菌落数 r-------平皿半径（cm）

t-------平皿培养基暴露在空气中的时间（按分钟计算） 10-------按10分钟计为单位

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