微生物实验指导书(1)(2)

二、基本原理：

曲霉菌用于酿造发酵的菌株较多，主要利用它在生产繁殖过程中分泌的蛋白酶，淀粉酶等作用发酵原料中的蛋白质、淀粉等成分生成发酵产品的有效成分及中间成分。

曲霉菌的繁殖方式主要是无性孢子繁殖。繁殖生长的过程：分生孢子遇到适宜的条件（温度、水分、养分）即开始吸水，体积膨胀（约是原体积1~2倍）继而开始发芽产生菌丝。菌丝生长到一定程度即会产生足细胞，足细胞上会产生分生孢子梗，在梗的顶端产生顶囊。顶囊又生出小梗，在小梗上会生出一串串的分生孢子，完成一个生长周期。

曲霉菌孢子发芽率的测定是将成熟休眠的曲霉菌的分生孢子，接种到培养基上控制一定温度（300C）培养4~5小时，在显微镜下观察发芽孢子和未发芽总孢子数的百分比。在发酵生产用菌的培养过程中具有很重要的意义。 三、仪器材料：

显微镜、培养箱、培养皿、凹玻片、培养基（米汁）、米曲霉种曲（固体粉末）、无菌稀释液 四、操作步骤：

1、将培养基放在搪瓷缸的水浴中于电炉上加热熔解（每四个小组做一份）。

2、取米曲霉种少许（约达拇指盖大小）放入盛有50ml无菌水的三角瓶内（内有4-5粒玻璃珠）充分振荡，使其孢子散成个体悬浮液。（全班做一份）。

3、用吸管吸取1ml孢子悬浮液，放入盛有9ml无菌水的试管内，充分振荡晃匀做10倍梯度稀释。（每四个小组做一份）

4、取一片血盖片擦干净，另取一支1ml吸管，取一滴试管内的孢子稀释液放在血盖片上，另取一只玻璃棒蘸取一滴加热融化的培养基快速与血盖片上的孢子稀释液混合均匀，并使其涂布面积的直径控制在10mm以内，在10秒内完成。

5、待血盖片上的培养基涂布层冷却凝固后，取一凹玻片，将血盖片上的涂布层扣在凹玻片上的凹窝内。然后将凹玻片放在显微镜下用高倍镜观察。在每个视野内应有10个左右的孢子，若不符合要求应重新按第四条操作至符合要求。（每人做一份） 6、在培养皿内加入2ml左右的水，将制备好的培养基涂片放在培养皿内的小导管上，不要使涂片与水面接触。（每组2个人的涂片放在一个培养皿内分别作好标记）盖好盖，放在300C培养箱内培养4～5小时，取出放在显微镜下观察一个视野内发芽孢子和未发芽孢子数，查看3~4个视野，总数进行计算。

7、计算：

发芽率%=3～4个视野发芽孢子总数/3-4个视野和未发芽孢子总数×100%

（培养时间 h） 五、注意事项： 1、用培养基涂片时一定要趁热快速与菌液混合均匀涂布成光洁平整的培养层，否则会形成凹凸不平的培养面影响观察。

2、培养基涂片层扣在凹窝上以后血盖片千万不能再在载玻片上移动，否则会造成培养基涂片层断裂影响观察。

3、镜检时一定选取有代表性的3-4个视野观察技术，每个视野孢子数最多不能超过20个否则会出现漏计或重计。

4、发芽率的高低与培养时间有关，在计算发芽率时一定注明培养时间。

IV 课后小结：

1、这次实验很成功，大多数同学培养的出芽率都很正常。

2、这次实验从其几个班的整体分析，培养时间是很关键的，4-5小时。近5小时最好。

实验五 酵母细胞计数测定

一、实验目的

了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫?霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为

1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。

因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材

1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法

1．菌悬液制备：稀释10倍。

2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

五、实验作业： 将实验结果填入下表中：

次 数 中方格 细胞数 每小格细胞 平均数（N） 系数（K） 菌液稀释倍数 每ml菌悬液中所含细胞数 平均值

1 左 左 右 上 下 上 格 格 格 2 右 中 左 左 右 下 心 上 下 上 格 格 格 格 格 4×106 10 右 下 格 中 心 格 实验六 酵母出芽率死亡率测定

一、 目的要求：

1、 进一步掌握血球计数板的应用。2、学会出芽率、死亡率的测定。 二、 实验材料及仪器：

1、 菌液（分装在烧杯中+小滴管）2、显微镜、血球计数板3、吕

氏美兰（甲基蓝） 三、 样品稀释：

用10倍稀释法达每小格内有4～5个菌体为宜。 四、 操作步骤：

1、 制片：⑴摇匀 ⑵滴加菌样：多则吸去，少则滴加。 2、 计数：对位于双格线上的菌体若大部分在内格线上） （1） 采用只计两边法：计上不计下，计左不计右。 （2） 芽体小于菌体1／2时为细胞芽体，大于菌体1／2时为细胞。 （3） 计不同深度的细胞。 3、 死亡率的测定：

蓝者为死细胞（代谢停止，无还原能力）

无色为活细胞（还原能力强 蓝色 无色） 注意：（1）光线暗为好（2）聚光下降（3）位置对准（4）焦距很小：从侧面看几乎檫着，用细调丝下降载物台。

五、实验报告：

酵母出芽率

出芽次数 1 2 3 率 中格1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 平均序号 值 细胞 数 芽体 数 细胞 数／ml 芽体 数／ml 出芽 率 酵母死亡率 1 2 3 4 5 6 平均死亡值 率 活细 胞 死细 胞 实验七霉菌形态的观察

一、 目的要求：掌握工业生产中几种常用霉菌的形态特征，学习观

察霉菌的方法。

二、 实验材料：1、平皿菌落2、显微镜、大头针、载玻片等 三、 实验方法及步骤：

1、 菌落形态的观察：用肉眼或低倍镜观察霉菌形态。 2、 压滴法观察：

取一大头针挑出一完整菌体放于洁净载玻片上，用高倍镜观察，并绘图。

实验八、 培养基制备

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