微生物实验指导书(1)(4)

100------求100cm2培养基上的菌落数 3、求1M3空气中的活菌数

每立方米空气中活菌数=100cm2培养基上的菌落数/20×1000 20---100cm2培养基暴露10分钟（在空气中）相当于接受20升空气中的活菌数。

1000----将1升空气中的活菌数按称成1M3空气的活菌数。 实验十一、 微生物的分离技术（分离产蛋白酶的米曲霉） 一、目的要求

学会在无菌操作下进行纯种分离的操作方法。

二、基本原理

为了获取某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其它菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 三、实验仪器

1、三角瓶250ml 1个2、试管 4个 3、1ml吸管5支4、培养皿4个5、10ml吸管 1支 6、吸耳球 1个7、代分离菌种少许8、分离培养基

四、操作步骤

1．稀释分离前的准备工作：①将三角瓶、试管、吸管、培养皿用水刷洗干净。②在三角瓶中装入50ml蒸馏水，放入5-6粒玻璃珠用棉塞塞好，用牛皮纸包扎。③每支试管装入ml蒸馏水用棉塞塞好编号后用牛皮纸捆扎在一起。④将培养皿用纸包在一起。⑤有吸管的上端塞入长2cm左右的棉花、棉塞不得外露也不得过松过紧，分别用纸条包好。⑥吸耳球用纸包好。⑦将上述物品放入高压消毒器内，压力0.1 MPa灭菌20分钟后取出放入接种箱内冷却备用。⑧将分离培

养基放入搪瓷缸中倒入少量水放在电炉上加热煮沸至培养基全部熔解为止，连同搪瓷缸取下备用。 2．菌样的稀释分离：

①取被分离的菌样约0.005克左右（三角瓶菌种象大米粒2-3块）放入冷却后的三角瓶内的水中塞好棉塞后用力振摇5分钟以上使菌种孢子个个分离后放入接种箱内。

②用75%乙醇棉球对手进行消毒后再在接种箱内对试管外表面进行消毒。

③在接种箱内，按无菌操作要求用1ml吸管吸取三角瓶内菌液1ml放入1号试管内塞好棉塞后晃匀，并将用过的吸管放在1号试管中，依次类推做至4号试管。此时菌样已稀释50万倍，要求在三号或4号试管内每ml稀释液中含孢子在5-15个之间为宜。

④分别从3号、4号试管中吸取1ml稀释液放入2个培养皿中。 ⑤将煮沸熔解后的培养基冷却至450C左右（不能用温度计以感觉不烫手为宜）用75%乙醇棉球消毒后在接种箱内用10ml吸管吸取 15ml培养基放在4个培养皿内，每放完一个培养皿后迅速用手晃动平皿，使培养基在位未凝固前与菌液混合均匀。然后放在水平面台上待凝固后取出用纸包好扣于300C培养箱内培养2-3天观察结果。

五、注意事项：

1、被分离菌种的使用量一定要控制正确，要求三角瓶中每ml稀释液中含孢子数在5-10万个为宜，大于此数会导致分离失败。

2、向平皿中加入的培养基一定将温度控制在45-500C之间，而且要求加入时要迅速否则会引起凝固，无法吸取或培养基在平皿内提前凝固与稀释菌液混合不匀，凝固面不平的现象。

3、皿内培养基在凝固时一定放在水平面上，否则会造成培养基厚薄不均影响分离结果。

4、平皿一定要倒置放在培养箱内培养可防止杂菌和冷凝水进入。

六、实验报告：

分离培养基配制附后 分离培养基制备： 1、 配方：

酪蛋白0.4% KH2PO4 0.04% MgSO4 0.01% 琼脂 2% PH自然 2、 操作：（每小组配100ml，分装6支试管，每支15ml）

按上述配方称取酪蛋白0.4g放入100ml烧杯中加入0.1MNaOH溶液5ml放在电炉上小火加热熔解后，加入10ml0.4%KH2PO4（相当于干剂0.028g），10ml0.1%MgSO4(相当于干剂0.007g)混匀后加入75ml蒸馏水再加入2g琼脂加热搅拌溶解。分装试管，加棉塞灭菌。 （KH2PO4 , MgSO4 事先配成0.4%，0.1% 溶液）

实验十二、 大肠菌群的测定

一、 实验 目的 ：

1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 2、学习并掌握大肠菌群的检验方法 二、实验 原理：

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似（the most probable number-简称MPN）表示。 三、 材料

3.1 样品 :乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 3.2 菌种 :大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）

3.3 培养基及试剂 :单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液。 3.4 其它 :恒温箱、 药物天平、培养皿、载玻片等 四、流程：

大肠菌群检验程序如：

┌─────┐

│ 检样 │

└──┬──┘ ┌──┴──┐ │ 稀释 │ └──┬──┘ ┌─────┴─────┐ │ 乳糖胆盐发酵管 │ │ 36 ±1℃ ,24±2h │ └─┬───────┬─┘ ┌───┴─┐ ┌─┴───┐ │ 不产气 │ │ 产气 │ └──┬──┘ └─┬───┘ ┌──┴───┐┌───┴───────┐ │大肠菌群阴性││ 伊红美蓝琼脂平板 │ └──┬───┘│ 36 ±1℃ ,18～24 h │ ┌──┴──┐ └──┬─────┬──┘

│ 报告 │┌───┴─┐ ┌─┴───────┐ └─────┘│革兰氏染色│ │ 乳糖发酵管 │ └──┬──┘ │36 ±1℃ ,24±2h │ ┌─────┐ └─┬──────┬┘

┌─┴───┐┌──┴───┐┌─┴───┐┌─┴───┐ │革兰氏阳性││革兰氏阴性 ││ 产气 ││ 不产气 │

└─┬───┘│无芽胞杆菌 │└┬────┘└─┬───┘

│ └────┬─┘ │ │ ┌─┴────┐ ┌┴───┴─┐┌────┴─┐ │大肠菌群阴性│ │大肠菌群阳性││大肠菌群阴性│

└─┬────┘ └───┬──┘└────┬─┘ ┌─┴───┐ ┌──┴──┐ ┌───┴─┐ │ 报 告 │ │ 报 告 │ │ 报 告 │ └─────┘ └─────┘ └─────┘ 五、 操作步骤：1、 检样稀释

1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。

1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。

2、 乳糖发酵试验:将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

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