CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)(6)

二代测序RRBS

方法均与前述方法一致。验证质粒构建正确后则可进行后续转染细胞实验。

通用pUC19测序引物：（只选一端用于测序即可）

pUC-Fwd - M13：GTAAAACGACGGCCAGT

pUC-Rev - M13：CAGGAAACAGCTGTAAC

3）转染KYSE150等细胞。

首先培养细胞至汇合度70-90%。转染可利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，依照说明书进行转染。

转染方案如下：

稳转：

可先转染cas9，得到其稳转株。其筛选流程如下，待按照lipo2000说明书转染后，2-3d，收细胞，计数，将细胞稀释。60cells稀释在12ml培养基中，然后将这12ml培养基接种到96孔板中。待长成克隆，观察绿色荧光即可。或者直接进行流式单细胞分选，分选后的细胞分种到96孔板，待长成克隆。

单载体系统稳转可参照上述方法。

瞬转：依旧是参照说明书，转染后48-72小时收细胞，转染效率可参照GFP荧光信号，同时可进行WB或者qRT检测。

需注意的是sgRNA PCR产物的转染，其体系如下：

注：本实验中Cas9将选用pSpCas9(BB)-2A-GFP，含有GFP标签。

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