CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)(5)

二代测序RRBS

c．sgRNA双载体表达系统（构建到pUC19中）

若利用pUC19建立双载体表达系统，首先依旧是参照之前的方法，寻找target site，设计引物用于扩增U6+sgRNA scafford；Fwd引物需含E coRI，Rev引物需含HindIII 酶切位点。之后进行酶切连接等操作。

酶切体系如下：

U6+sgRNA PCR产物酶切pUC19质粒酶切

酶切产物纯化，使用QIAQuick PCR purification kit，纯化后可-20 °C保存。

连接：酶切后的质粒与PCR产物按照1：3，室温连接15min。

连接反应结束后，推荐用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基。（可选做）

后续转化大肠杆菌，热击转化，涂板，挑单菌落，摇菌，提质粒，测序检测

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