CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)(2)

二代测序RRBS

建到pUC19当中，成为双载体系统。

a．PCR扩增sgRNA表达结构。

PCR体系如下：

U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC

U6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA c NNNNNNNNN NNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段)

其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。

PCR反应条件如下：

该程序固定，不推荐更改。

PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分。条带位置为370bp。

PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收。。

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)(2)在线全文阅读。