二代测序RRBS
一、材料试剂准备
1）质粒：
pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。
pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。
pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。
上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。
2）超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)
3）高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。
4）Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一般检测。
5）QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)
6）QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)
7）Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014)，如需要将sgRNA构建到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。
8）T7 DNA ligase with 2× rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者T4 DNA ligase，二者无区别。
9）Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)
10）dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)
11）MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)
12）T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)
13）Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)
14）Adenosine 5′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S) 15）SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)
二、实验流程
1）确定target site。根据CRISPR在线设计工具http://crispr.mit.edu/设计sgRNA，（还有其他设计工具，推荐该软件）。将目的基因250bp以内的核苷酸序列输入，避免内含子，约10min将会给出备选的target site。
或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为target site，一般target site可选在正义链或者反义链，二者均可。
2) 准备sgRNA表达体系。三种方案可选：a, 直接使用PCR扩增纯化产物，该产物片段含有U6+sgRNA，约370bp；b, 将sgRNA载体构建到
pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中，即单载体系统；c, sgRNA载体构建到构
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