CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)(4)

二代测序RRBS

其中pSpCas9(BB)-2A-GFP 100ng, 根据浓度调整体积。连接1hr。

设计对照，对照同上，只是不加oligo。

连接反应条件如下：

连接反应结束后，推荐使用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基，该步骤可选，但强烈建议该步操作。

37 °C 30 min, 70 °C 30 min。之后保存到-20°C，可保存至少一周。

该步骤结束后的产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用Stbl3感受态。采取热击的方法：取2ul PlasmidSafe后的质粒，加入到20ul感受态中，冰上10min，热击42 °C，30 s，立即置于冰上2min，加入100ul SOC，直接涂板。使用含有Amp100的LB平板。37°C过夜。第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的板中长有克隆。

挑取单克隆摇菌，用QIAprep spin miniprep kit进行质粒提取。用U6-Fwd primer做为测序引物测序。

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