马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析 - 图文(6)

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

表3-4马氏珠母贝三个群体生长相关基因的相对表达量（2-△CT） Table 3-4 relative expression of growth-related genes at the three

populations from P. martensii (2-△CT)

群 体 对 照 群 体 (B) 普通养殖群体(C) 选 系 F5 (A)

TβR I 3.21±1.62a 1.66±0.42a 2.40±1.84a

EGFR 5.25±2.05a 3.56±2.03ab 2.34±2.35b

GHITM 3.47±1.09a 2.43±0.88b 1.99±0.65b

FGF18 1.40±0.44a 1.05±0.26a 1.48±0.55a

注：同列有相同字母表示差异不显著

3.3.3 生长性状与生长相关基因表达量的相关性

相关分析结果表明，四个侯选生长基因的表达量与壳长、壳高、壳宽、壳重、总重、总干重、软体干重和软体湿重8个生长性状均呈正相关，相关系数为0.387-0.998，其中TβR I与壳长的相关水平显著（P < 0.05），总体上TβR I与各生长性状的相关系数最高，其次是GHITM和EGFR，而FGF18与各生长性状的相关系数最低。详见表3-5。

表3-5 马氏珠母贝生长性状与生长相关基因表达量的相关系数

Table 3-5 Correlation coefficient of growth traits and growth-related genes from P. martensii

壳 长 壳 高 壳 宽 总 重 总 干 重 壳 重 软体干重 软体湿重

TβR I 0.998 0.898 0.922 0.973 0.989 0.989 0.965 0.95

＊

EGFR 0.646 0.89 0.862 0.768 0.711 0.709 0.787 0.819

GHITM 0.741 0.943 0.922 0.846 0.798 0.796 0.862 0.888

FGF18 0.712 0.387 0.44 0.581 0.647 0.65 0.555 0.509

注：＊表示相关水平显著（P < 0.05）

3.4 讨论

重要经济贝类遗传育种的目标在于不断提高和稳定经济性状出现的概率。许多经济性状是数量性状，这些性状受多种基因共同影响，在动植物遗传育种中通过构建高密度分子标记遗传连锁图，对重要数量相关性状QTL进行精细定位，确定其在染色体上的位置和效应，对遗传改良具有重要意义[60]。遗传连锁图可应用于分子标记辅助育种，是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段而进行的选育，由于遗传标记的等位基因变异与经济性状的表型变异相连锁，因此分子标记可以提供与经济性状

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相关的 DNA 水平上的遗传信息[61]。马氏珠母贝中QTL定位也有研究，邓岳文等[62]利用自主开发的50个马氏珠母贝EST-SSR标记，对马氏珠母贝快速生长选育群体F4 90个个体基因组DNA进行PCR扩增，然后使用统计软件SPSS对50个微卫星标记与马氏珠母贝总重、壳长、壳高、壳宽和韧带长的相关性进行分析，结果显示，共有18个微卫星标记与马氏珠母贝的5个生长性状相关，9个标记与总重显著相关（P < 0.05），12个标记与壳长显著相关，其中3个是极显著相关；14个位点与壳高显著相关，其中3个为极显著相关；6个位点和壳宽显著相关，其中一个标记为极显著相关；5个标记与韧带长显著相关，对同一标记不同基因型间进行多重比较，找到了与5种性状相关的基因型。邱樱[63]也通过EST-SSR标记与相关性状的关联分析，得到了马氏珠母贝2个与生长性状显著相关的微卫星标记，一个微卫星标记与壳高和总重呈显著相关，另一个微卫星标记与壳宽和总重呈现显著相关。

数量性状的QTL定位归根结底要对功能基因进行研究，寻找与性状连锁的基因，可以更直接有效地研究经济性状与基因的相关性。MSTN、TGF-β、EGF、FGF、GHITM等生长因子及其相关信号通路上的其他因子控制着肌肉，上皮，神经等的生长与发育，因此是生长性状相关的侯选基因。这些生长因子的共同特征是在细胞生长过程中介导细胞增殖[47]。目前贝类生长相关基因的研究报道还比较少，Hu等[64]和 Kim等[65]分别克隆了栉孔扇贝和海湾扇贝的MSTN基因，荧光定量分析基因在各组织中的表达，发现MSTN在闭壳肌中的表达量最高；Akalal等[66]从海兔中鉴别出贝类生长因子MDGF，在神经发生的胚胎期至变态后表达量上升，在成体中枢神经系统没有表达，认为它在神经发生中与神经细胞增殖相关；Willem等[67]在静水椎实螺中发现了类似EGF(L-EGF)因子，发现它在神经的发生中起作用。马氏珠母贝方面，Zhou等[68]对生长相关TGF-β信号通路上的Smad3和激活素受体I型基因进行克隆和鉴定，发现这两个基因在壳的形成和修复过程发挥重要作用，Zhou等[69]还研究了马氏珠母贝BMP2和Smad3基因表达的关联性，结果显示，BMP2和Smad3在mRNA水平的表达显著相关；而张立娟等[70]则用外源的生长激素处理马氏珠母贝，结果显示，激素处理提高了马氏珠母贝胰岛素相关受体基因的表达量，这与其在软体动物中作为胰岛素样生长因子受体的作用相一致。

本部分实验从珍珠囊转录组Unigene序列功能注释的数据库中，筛选生长相关侯选基因，在育珠期第210天检测马氏珠母贝三个群体四个基因在贝体中的整体表达水平，研究四个基因表达量与生长性状的关联性，实验结果显示四个基因与马氏珠母贝各生长性状呈正相关，说明在马氏珠母贝中这些基因对生长起正调控作用。马氏珠母贝三个群体存在生长差异是本部分实验得以进行的基础，为查找与性状差异相关的基因提供前提条件。本实验只检测马氏珠母贝生命周期中一个时间点上相关基因与生长性状的关系，对马氏珠母贝生命过程中各个时间点的检测，将有利于深入了解相关基因在各个时期对生长所产生的影响。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

4马氏珠母贝生长相关基因的克隆和组织表达研究

为较深入地研究马氏珠母贝生长相关基因和蛋白的结构与功能，用RACE技术克隆得到基因的cDNA全长，用软件分析预测基因和蛋白质的结构和功能，以及进行氨基酸序列同源性比对和进化分析，并检测基因在各组织中的表达。

4.1实验材料

4.1.1实验动物和菌种

本实验材料来自湛江市徐闻县西连镇大井村养殖基地，2龄贝，壳长5-6cm，取外套膜后立即放入液氮中冷冻保存。用于制作感受态细胞的细菌为E.coli DH5α，含 DH5α的菌种或感受态于含15%灭菌甘油的LB（Amp-）培养液中，-80℃保存备用。 4.1.2主要仪器设备

表4-1 本实验所用仪器设备

Table 4-1 The main instruments and equipments in this reseach

仪器名称 样品组织破碎仪 PCR仪 电流仪 水平电泳槽 凝胶成像系统 核酸定量仪 高速冷冻离心机 超净工作台 恒温金属浴

生产制造商 德国QIAGEN 美国Bio-rad 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 美国Bio-rad Thermo Scientific 德国eppendorf

上海上净净化设备有限公司 上海一恒科技有限公司

型号 TissueLyser II S1000 DYY-II2 DYCP-32 170-8170 NanoDrop 2000c 5804R CA-920-3 TU-100 GZX-9240MBE SPX-250 SHZ-C MDF-U73V 各种规格 DK-8D型 SYQ-MDX-280 7500 JA2003 111-101DT

数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 生化培养箱 振荡恒温摇床 超低温冰箱 微量移液枪 恒温水浴锅 蒸汽高压灭菌锅 荧光定量PCR仪 电子天平 数显游标卡尺

上海跃进医疗器械厂

上海博讯实业有限公司医疗设备厂 日本SANYO公司 德国eppendorf 上海一恒科技有限公司 上海申安医疗器械厂 ABI Applied Biosystems 上海良平仪器仪表有限公司 桂林广陆数字测控股份有限公司

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4.1.3主要试剂

表4-2 本实验主要试剂

Table 4-2 The main reagents in this reseach

试剂名称

焦碳酸二乙脂（DEPC）

生产商

生工生物工程（上海）有限公司

Trizol Reagent RNA Invitrogen公司 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 美国 Clontech公司 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 宝生物工程 (大连) 有限公司 TaKaRa Ex Taq TaKaRa Ex Taq Buffer TaKaRa LA Taq TaKaRa LA Taq Buffer dNTPs

TaKaRa rTaq mix 琼脂糖(Agrose)

Thermo Gene JET Gel Extraction Kit pMD19-T simple Vector DNAMarker

三氯甲烷（Trichloromethane） 异丙醇（iso-Propyl alcohol ） 无水乙醇（absolute alcohol） 4S Green Nucleic Acid Stain

DyNAmo? ColorFlash SYBR? Green qPCR Kit

宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 生工生物工程（上海）有限公司 Thermo Scientific

宝生物工程 (大连) 有限公司 宝生物工程 (大连) 有限公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂

生工生物工程（上海）有限公司 Thermo Scientific

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4.1.4主要的溶液和培养基及配制方法

表4-3 本实验主要溶液和培养基及配制方法

Table 4-3 The main solution, culture medium and preparation method in this reseach 溶液名称 5×TBE

配制方法

Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5mol/L EDTA (pH 7.9) 20mL， 加水定容至1L

加灭菌双蒸水配制成100mg/mL的母液，分装至每管1mL，-20℃保存备用

1.1g无水CaCl2溶于水后定容至100mL，0.22μm微孔滤器过滤，4℃保存

氨苄青霉素母液

0.1 mol/L CaCl2

15%甘油的0.1 mol/L 按体积比，甘油：0.1mol/L 氯化钙=3:19配制，高温高压灭菌备CaCl2 用 无RNA酶水

双蒸水加入DEPC，使DEPC的终浓度为1%，密封，室温过夜，

121℃高压灭菌，30min，彻底分解DEPC 按体积比，无RNA酶水：乙醇=1:3配制

酵母提取物（Yeast extract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g，氯化钠（NaCl）10g，定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存备用

无RNA酶75%乙醇

LB（Amp-）培养液

酵母提取物（Yeast extract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g，氯

LB（Amp-）固体培养基 化钠（NaCl）10g，琼脂粉15g，定容至1L，高温高压灭菌，倒

平板，4℃保存备用 LA（Amp+）培养液

LB（Amp-）培养液冷却至55-60℃加入100mg/mL的Amp，使 培养液中Amp的终浓度100μg/mL，4℃保存备用

LB（Amp-）固体培养基冷却至55-60℃加入100mg/mL的Amp，使培养液中Amp的终浓度100μg/mL，倒平板，4℃保存备用

LA（Amp+）固体培养基

4.2实验方法

4.2.1引物的设计

通过cDNA末端快速扩增技术得到基因的全长，RACE引物信息如表4-4：

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