马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析 - 图文(5)

广东海洋大学硕士学位论文

表2-6 马氏珠母贝珍珠性状与矿化基因表达量的相关系数 Table 2-6 Correlation coefficients of pearl traits and expression level

of mineralization genes from P. martensii

珍珠层厚度 珍珠质重量

NACREIN 0.965 0.979

MSI60 0.943 0.922

PIF177 0.408 0.460

N19 -0.214 -0.270

2.4 讨论

人工养殖游离有核珍珠的培育是通过把珠核与小片植入受体贝的核位，经过相互作用形成珍珠囊，珍珠囊分泌珍珠质形成有核珍珠，普遍认为珍珠囊细胞与贝壳外套膜上皮细胞在生理和组织上是相似的[50]，因此珍珠囊一直是国内外学者们的研究热点，特别是珍珠囊是如何形成的问题。杜晓东等[51]通过透射电子显微镜观察植核后不同发育时期珍珠囊的形成，初步认为马氏珠母贝珍珠囊表皮细胞来源于移植小片, 即移植小片的表皮细胞增殖形成了珍珠囊；在分子水平上，Erin L. McGinty 等[52]用大珠母贝和黑蝶贝异体进行移植育珠，在珍珠囊中检测物种特有珍珠质矿化基因N66和N44的表达情况，以研究供体和受体在珍珠形成过程中所起的作用，结果表明，供体贝是珍珠培育过程中生物矿化的重要贡献者；随后E.L. McGinty 等[53]以大珠母贝和黑碟贝异体移植构建实验材料，通过转录组分析受体贝和供体贝对珍珠囊中矿化相关基因表达的贡献，结果表明，供体贝的外套膜组织（小片）对珍珠囊矿化基因的表达起主要贡献。Nariaki Inoue等[54]用马氏珠母贝矿化相关基因（msi60、n16、nacrein、msi31、prismalin-14、aspein)研究了外套膜上皮细胞基因的表达模式与珍珠囊形成的联系，结果显示，外套膜矿化基因的表达不确定，在珍珠囊形成的前后表达模式不一样，并认为珍珠囊中外套膜矿化基因的表达可能受到受体贝的调节。

本实验马氏珠母贝三个群体自身同时作供体贝和受体贝，构建实验材料，检测马氏珠母贝三个群体珍珠质矿化能力的差异，并检测相关基因对珍珠性状所产生的影响。所选四个马氏珠母贝珍珠质矿化相关基因，三个基因与珍珠性状呈正相关，一个基因（N19）与珍珠性状呈负相关，Funabara D等[55]通过RNA干扰NACREIN基因的表达，结果发现珍珠层的结构发生了紊乱，因此NACREIN参与了珍珠层的形成；Asakura T等[56]研究发现MSI60具有结合钙离子的能力，Sato Y等[57]通过原位杂交研究植核后38天珍珠囊中MSI60的表达情况，发现优质珍珠中MSI60的表达量很高，因此MSI60与珍珠囊中珍珠层的形成有关；Michio Suzuki等[58]在珍珠层中发现了一种PIF酸性基质蛋白，通过免疫定位，RNA干扰和体外钙酸盐体外结晶实验，认为PIF调控珍珠层形成；而Masato Yano等[59]从珍珠层中分离出一种蛋白N19，Northern blot实验发现N19在外套膜中的mRNA表达量比在缘膜区多一些，而体外重组的N19抑制碳酸钙的结晶，说明N19存在于珍珠层并在钙化的过程中起负调控作用。

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

本实验以三个马氏珠母贝群体各自同时做受体贝和供体贝为实验材料，选取四个马氏珠母贝表达量较高（与内参比），表达较稳定（个休间差异小）的基质蛋白NACREIN、MSI60、PIF177 、N19，检测植核后第210天不同群体珍珠囊中基因的表达情况，分析珍珠性状与相关基因的相关性。基质蛋白基因的筛选主要考虑如下：表达量大可能对珍珠形成的影响比重更大，并且基因表达量高使得定量更加准确。而选取植核后第210天的珍珠囊来检测珍珠质矿化基因表达量的主要考虑为：植核后贝体受到伤害恢复生长需要时间，完整珍珠囊的形成需要时间，而且珍珠质的分泌是一个相对缓慢和连续不断的过程，留有足够长的珍珠生成时间，测量更加精确，结果更加可靠。

本实验研究四个珍珠质矿化基因表达量与珍珠性状相关性，为以珍珠质分泌能力强为目标性状的马氏珠母贝分子辅助育种提供理论支持。

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3生长性状与生长相关基因表达量的相关分析

3.1实验材料

同上2.1

3.2实验方法

3.2.1马氏珠母贝三个群体生长性状的跟踪测量

植核育珠前和植核育珠后的第90天，第150天和第210天随机取三个群体各50个个体，数显游标卡尺测量壳长，壳高，壳宽，精确到0.01mm，电子天平称量壳重，总重等性状，精确到0.01g，采用M±SD统计样本，用SPSS19.0软件对数据进行分析处理，显著性检验水平为P < 0.05。

3.2.2马氏珠母贝三个群体生长相关基因的荧光定量

1、实验材料

植核育珠后第210天三个群体各随机取10个个体，每个个体取闭壳肌、鳃、肝胰腺、外套膜、性腺和足六种组织加入灭菌的抗冻管中，立即加入液氮中速冻至少30min，然后迅速转移到-80℃超低温冰箱保存备用。

2、RNA的提取 同上2.2.2 3、cDNA的合成 同上2.2.2 4、引物设计

以本实验室马氏珠母贝珍珠囊转录组数据库为基础，筛选出四个生长相关基因，转化生长因子受体I型（TGF-β receptor type-I，TβR I），表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor，EGFR），生长激素诱导的跨膜蛋白（Growth hormone-inducible transmembrane protein，GHITM）和成纤细胞生长因子（Fibroblast growth factor18，FGF18），得到的部分核酸序列，用于设计荧光定量引物，引物信息如下：

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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

表3-1 引物信息

Table 3-1 Primers information

引物名称 TβR I-A TβR I-S EGFR-A EGFR-S FGF18-A FGF18-S GHITM-A GHITM-S ACTIN-S ACTIN-A GAPDH-S GAPDH-A

引物序列

TCCCATAATACCAAACCAAACG TGACCTCGCTCCATCAGACA GTACGATTCCCCGTTCCTCT ATGCCCCTTGGTTGTCTTTT GAAATGTTACCCGTCTGTGCC GGTGGGAATTGATACGTTGATC GGGTCATCCACGCCAGTT GAGGAGGTACGACAGCGAGTT GTGTAAGGCGGGGTTTGCT GGGTCCTTCAGCGTTAGTATCTT CACTCGCCAAGATAATCAACG CCATTCCTGTCAACTTCCCAT

219 171 113 127 产物长度 135

TM值（℃） 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59

235

5、荧光定量PCR反应程序及体系 同上2.2.2

6、以β-actin作为内参，每组实验重复 10 次，用△CT值法进行基因相对表达量的计算，用统计软件SPSS19.0 Duncan法进行多重比较，差异显著性水平为P < 0.05。 3.2.3 生长性状与相关基因表达量的相关分析

用统计软件SPSS19.0对植核后第210天生长性状和相关基因的表达量，做简单相关分析，并对相关系数做Person检验，显著性水平为P < 0.05。

3.3实验结果

3.3.1马氏珠母贝三个群体生长的比较

从表3-2和表3-3可以看出，植核育珠后第90天到第210天，统计结果表明，选系F5（A）壳长和壳高的生长率明显大于对照群体（B）与普通养殖群体（C）。选系F5（A）具有壳长和壳高生长速度快的优势(见表3-3)。植核育珠后第210天三个群体之间的生长性状存在明显差异（见表3-2）。

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表3-2 马氏珠母贝三个群体三个时间点生长性状的测量结果 Table 3-2 Measurement results of growth traits at three diferent times

from P. martensii three populations

群体 生长阶段(天) 壳长(mm) B C A B C A B C A 表3-3 马氏珠母贝三个群体两个时间段的生长比较

Table 3-3 Compares the growth of the three populations from P. martensii at two periods 群 体

生长阶段(天) 0-90

对 照 群 体 (B)

90-210 0-90

普通养殖群体(C)

90-210 0-90

选 系 F5 (A)

90-210

2.19

3.57

0.44

4.75

4.4

2.14 4.91

1.95 4.08

0.87 2.68

4.9 5.78

4.8 6.12

1.75 5.83

1.54 6.18

0.67 2.98

5.52 5.44

5.66 5.59

壳长增长(mm) 5.08

壳高增长(mm) 5.27

壳宽增长(mm) 3.45

壳重增长(g) 7.54

总干重增长(g) 7.81

植核前

植核90天

植核210天

64.89±3.62 58.27±3.04 61.48±3.41 69.97±4.71 64.11±4.30 66.39±4.05 71.72±4.89 66.25±4.40 68.58±3.98

壳高(mm) 66.23±3.75 61.82±2.94 62.45±3.61 71.50±5.74 68.00±3.89 66.53±4.31 73.05±4.83 69.95±3.99 70.10±4.00

壳宽(mm) 22.16±1.38 20.57±1.12 21.51±1.64 25.61±1.85 23.55±1.54 24.19±1.33 26.28±1.92 24.42±1.58 24.63±1.24

壳重(g) 14.11±1.67 12.48±1.44 13.81±1.71 21.64±4.01 17.92±3.08 19.59±2.71 27.17±4.94 22.81±3.55 24.34±3.40

总干重(g) 15.25±1.79 13.83±1.52 14.83±1.82 23.06±4.19 19.42±3.30 20.96±2.88 28.72±5.23 24.22±3.78 25.78±3.58

3.3.2 生长相关基因的荧光定量结果

从表3-4中得知，TβR I、EGFR 和GHITM在对照群体中的表达量较另外两个群体高，而FGF18在选系F5中的表达水平比对照群体和普通养殖群体高，但差异不显著。总体而言，各生长相关基因在普通养殖群体中的表达水平最低。

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