马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析 - 图文(4)

马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析

2育珠性状与珍珠质矿化相关基因表达量的相关分析

2.1实验材料

2001-2002年期间，从广西北海涠洲岛收集3批自然群体，转移到雷州乌石海区养殖。2003年，利用采集的3批亲本构建了1个选育基础群体，以壳型（壳长和壳宽）为育种目标，通过连续5代的连续选择，培育出选系F5，同时从亲本群体随机选择个体繁育对照群体（B），从海区养殖群体中随机挑选亲本培育普通养殖群体（C）。本部分实验利用选系F5（A）、对照群体（B）与普通养殖群体（C）进行植核育珠，按常规方法海区休养及育珠养殖，根据实验要求，定时取样。

2.2实验方法

2.2.1马氏珠母贝三个群体育珠性状的统计分析

1、死亡率和留核率的统计

植核后的第7天、第15天、第30天、第90天第、第150天、第210天，从三个群体中各随机抽取5笼（每笼38个育珠贝），统计植核后三个群体育珠贝的成活率和留核率。

2、珍珠性状的测量

植核后第90天、第150天和第210天，从每个群体中随机取30颗珍珠，游标卡尺测量珍珠的直径，电子天平称量珍珠重量；用小铁锤去除珍珠层，测量珠核的直径，称量珠核的重量，对应数据作差得到珍珠层的厚度（精确到0.01mm）和珍珠质的重量（精确到0.001g）。

3、数据处理

采用M±SD统计样本，用统计软件SPSS19.0对数据进行分析处理，差异显著性检验水平为P < 0.05。

2.2.2马氏珠母贝三个群体珍珠质矿化相关基因的荧光定量

1、实验前的准备

无RNA酶金属工具的准备：用双蒸水清洗干净小剪刀，镊子，解剖刀等，烘干，用锡箔纸包裹于烘箱中180℃烧烤8h以上；无RNA酶塑料耗材的准备：在大烧杯中配制1‰ DEPC水，将枪头、离心管等浸泡其中，用塑料薄膜和锡箔纸封闭瓶口于通风橱中摇床上缓慢摇过夜，121℃高压灭菌30min，倒掉水，烘箱中80℃的烘干；一般无菌塑料耗材和金属工具的处理，需要清洗干净，烘干，用容器分装并用报纸或牛皮纸包裹，然后121℃高压灭菌30min，90℃烘箱中烘烤除净水份，备用。

2、RNA的提取

植核育珠第210天后从三个群体中分别随机取10个生产优质珍珠的珍珠囊，每

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个珍珠囊分成2-3份装入灭菌的抗冻管中，立即放入液氮中速冻至少30min，然后迅速转移到-80℃超低温冰箱保存备用。根据Trizol Reagent RNA说明书进行RNA提取操作，略有变化：

（1）取新鲜组织或从-80℃冰箱取组织，2mL无RNA酶离心管中每50mg组织加入1mL Trizol，加入小钢珠，用组织匀浆机匀浆3-5min，使组织破碎完全，室温放置5min，使核蛋白与核酸完全分离；

（2）每1mL Trizol加入0.2mL 4℃预泠的三氯甲烷；

（3）手动剧烈摇晃1min，室温放置3 min，4℃，12000g离心15min； （40取上清于1.5 mL无RNA酶离心管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min；

（5）4℃，12000g离心10min；

（6）弃上清，加入1mL无RNA酶75%乙醇，轻轻颠倒使沉淀悬浮于溶液中，4℃，7500g离心5 min；

（7）弃上清，超净工作台上放置5-10min，20-30?L无RNA酶水溶解RNA； （8）用核酸定量仪检测RNA的浓度和纯度； （9）用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性； 3、cDNA的合成

用核酸定量仪检测RNA的纯度和浓度，质量合格的RNA用 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 合成cDNA，详细操作如下：

（1）0.2mL的管中制备下列模板RNA/引物混合液，总体积6?L；

模板RNA 500ng Random Primers（25μm） 1?L RNase-free ddH2O up to 6?L

（2）70℃保温10min后迅速在冰上冷却2min以上；

（3）离心数秒种使模板RNA/引物的变性溶液聚集于0.2mL离心管底部； （4）在上述离心管中配制下列反转录反应液：

上述模板RNA/引物变形溶液 5×M-MLV Buffer dNTP Mixtue（各10mM） RNase Inhibitor（40 U/?L ）

RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/?L ） RNase free dH2O 总体积

6.0?L 2.0?L 0.5?L 0.25?L 0.5?L 0.75?L 10.0?L

注意：起始模板RNA量超过500ng，RTase M-MLV（RNase H-）的使用量就大于0.25?L；

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（5）以Random Primers 作引物时先进行30℃，10min，然后42℃保温1h； （6）70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接PCR扩增或-20℃保存备用。

4、引物设计

查阅相关文献，确定目标基因，从NCBI上下载马氏珠母贝珍珠质形成相关基因的序列，用Primer5.0设计荧光定量的引物。

表2-1 引物信息

Table 2-1 Primers information

引物名称

引物序列

引物来源

GenBank: D83523.1 GenBank: D86074.1 GenBank: AB332326.1 GenBank: AB236929.1 Unigene73353 GenBank:AB205404.1

产物长度 102 240 80 178 171 219

TM值（℃） 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59 59

NACREIN-A GGGTGATGTCCCTTTAAGATGTG NACREIN-S CGATTTTGTCGTCGTTGGAGT MSI60-A MSI60-S N19-A N19-S PIF177-A PIF177-S ACTIN-S ACTIN-A GAPDH-S GAPDH-A

AATGTCTCCTAATGCGTCCCT GGTGGTGTTGGTTTCTACGG CGGTTATGACTGCTTTGTTGC TTTCACTTTTGATGGGTATGGC CATACGCCATACCACTAGGACA CAGTATTGGAGCAAACGACAGA GTGTAAGGCGGGGTTTGCT GGGTCCTTCAGCGTTAGTATCTT CACTCGCCAAGATAATCAACG CCATTCCTGTCAACTTCCCAT

5、荧光定量PCR反应程序及体系

反转录得到的cDNA用于荧光定量PCR，荧光定量为Thermo Scientific公司生产

的 DyNAmo? ColorFlash SYBR? Green qPCR Kit（F-416XL）试剂盒，反应程序为：

94℃ 4min 94℃ 30sec

59℃ 15sec 40cycles

72℃(收集荧光信号) 35sec

20?L反应体系如下：

Premix 上游引物 下游引物 cDNA模板 ddH2O 总体积

10?L 0.8?L 0.8?L 0.8?L 7.6?L 20?L

6、以 GAPDH作为内参,每组实验重复10次，用△CT值法进行基因相对表达量

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的计算，用软件SPSS19.0 Duncan法进行多重比较，显著性检验水平设为P < 0.05。 2.2.3 育珠性状与珍珠质矿化相关基因的相关分析

用软件SPSS19.0对珍珠层性状与珍珠质矿化相关基因的表达量进行简单的相关分析，对相关系数作Person检验，显著性水平为P < 0.05。

2.3实验结果

2.3.1马氏珠母贝三个群体育珠性能的比较

马氏珠母贝三个群体休养期及育珠期成活率、留核率、珍珠层厚度和珍珠质重量的比较如下：1）植核后第7天、第15天、第30天、第90天、第150天、第210天，选系F5（A）的成活率均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C），育珠期结束时，即植核育珠后第210天的统计结果表明，选系F5比对照群体的成活率提高了8.79%，选系F5比普通养殖群体的成活率提高了7.61%，差异不显著。详见表2-2。

表2-2 马氏珠母贝三个群体成活率的统计

Table 2-2 Statistics the survival rate of the three groups from P. martensii

时 间 植核 7天 植核 15天 植核 30天 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 86.84±6.88a 81.02 ±7.53a 73.42±13.50a 46.49±5.48b 42.63±3.43b 39.91±4.53a

普通养殖群体(C) 84.62±7.35a 81.38±5.42a 68.61±11.14a 53.51±4.02ab 39.47±6.45b 40.35±9.66a

选系F5(A) 86.23±6.28a 84.82±6.28a 76.75±9.86a 55.26±2.63a 46.84±4.71a 43.42±10.09a

注：每行有相同字母表示差异不显著

2）从表2-3可知，植核后第7天、第15天、第30天、第90天、第150天、第210天，选系F5（A）的留核率均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C）。植核后第210天的统计结果表明，选系F5比对照群体留核率平均提高了47.94%，选系F5比普通养殖群体的留核率平均提高了46.06%，差异显著（P < 0.05）。

表2-3 马氏珠母贝三个群体留核率的统计

Table 2-3 Statistics leave the nuclear rate of the three groups from P. martensii

时 间 植核 7天 植核 15天 植核 30天 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 87.98±9.21b 80.01±10.37b 72.88±15.65b 45.96±3.5a 34.68±6.08b 33.33±3.81b

普通养殖群体(C) 93.40±6.58ab 85.81±6.49ab 78.35±8.79a 42.89±2.28a 35.63±1.93b 33.76±5.59b

选系F5(A) 94.99±4.29a 87.14±6.72a 80.89±5.85a 52.02±9.45a 50.08 ±10.04a 49.31±2.84a

注：每行有相同字母表示差异不显著

3）从表2-4可以看出，植核后第90天、第150天和第210天选系F5（A）的珍珠性状均高于对照群体（B）和普通养殖群体（C）。育珠期结束，即植核后第210天

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的统计表明，选系F5的珍珠质重量比对照群体和普通养殖群体分别提高了22.02%，18.75%，差异不显著；选系F5的珍珠层厚度比对照群体和普通养殖群体分别提高了30.42%，24.28%，差异显著（P < 0.05）。

表2-4A 马氏珠母贝三个群体珍珠质质量的统计

Table 2-4A Statistics the pearl weight of the three groups from P. martensii

时 间 植核 90天 植核150天 植核210天

对照群体(B) 珍珠质重量(g) 0.069±0.027b 0.100±0.043a 0.109±0.029a

普通养殖群体(C) 珍珠质重量(g) 0.077±0.031ab 0.102±0.039a 0.112±0.039a

选系F5(A) 珍珠质重量(g) 0.084±0.032a 0.114±0.025a 0.133±0.044a

注：每行有相同字母表示差异不显著

表2-4B 马氏珠母贝三个群体珍珠层厚度的统计

Table 2-4B Statistics the pearl thickness of the three groups from P. martensii

时 间 植核 90天 植核 150天 植核 210天

对照群体(B) 珍珠层厚度(mm) 0.187±0.074a 0.266±0.110a 0.296±0.075b

普通养殖群体(C) 珍珠层厚度(mm) 0.205±0.074a 0.279±0.095a 0.313±0.094b

选系F5(A) 珍珠层厚度(mm) 0.210±0.078a 0.306±0.066a 0.389±0.098a

注：每行有相同字母表示差异不显著

2.3.2 珍珠质矿化相关基因表达的定量结果

从表2-5中可以看出，植核后第210天三个群体珍珠囊中矿化基因的相对表达量有差异，但差异不显著。选系F5 NACREIN和MSI60的表达量高于对照群体和普通养殖群体，PIF177在普通群体中的表达量最高，其次到选系F5，N19在对照群体中表达量最高，而在普通养殖群体中表达量最低。

表2-5 植核后第210天三个群体矿化基因的相对表达量（2-△CT）

Table 2-5 The relative expression of mineralization genes of the three populations from

P. martensii 210 days after implantation nucleus (2 -△CT)

对照群体(B)

NACREIN 0.926±0.368a

MSI60 0.277±0.104a 0.261±0.149a 0.330±0.117a

PIF177 0.208±0.108a 0.303±0.120a

N19

0.493±0.234a 0.323±0.172a

0.279a 普通养殖群体(C) 0.988±选系F5(A)

1.093±0.415a

注：同列相同字母表示差异不显著

0.282±0.262a 0.394±0.178a

2.3.3 珍珠层厚度与珍珠质矿化相关基因的相关性

简单相关分析的结果显示，NACREIN，MSI60和PIF177与珍珠层厚度和珍珠质重量成正相关，相关系数从0.408-0.979；而N19与珍珠性状成负相关，与珍珠层厚度和珍珠质重量的相关系数分别为-0.214和-0.270。详见表2-6。

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