抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(5)

江雨大学硕士学位论文２．３．３水解过程中抗氧化活性的变化依据Ｆｏｌｉｎ．酚法牛血清白蛋白标准曲线（见附录图１）测定不同时间点的蛋白浓度，并调整成相同的浓度。本章采取不同时间点水解物测其抗氧化性，研究水解时间对玉米肽抗氧化活性的影响。Ｏ．６Ｏ．５０．４槲篮０．３蜒０．２０．１ＯＯ．５１．５２．５３．５４．５５．５水解时间（ｈ）—ｅ—ＤＰＰＨ自由基清除率—§一ＡＢＴｓ自由基清除率＿１＆一超氧阴离千清除率图２—４水解时间对水解液ＤＰＰＨ清除率的影响Ｆｉ９２—４ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅｏｎＤＰＰＨｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ从图２－４可以看出，随着水解时间的增加（平均分子量变小）玉米蛋白水解物抗氧化活性不断变化。ＤＰＰＨ自由基淬灭能力（蛋白浓度１０ｍｇ／ｍＬ）在水解２．５ｈ前普遍较高并呈下降趋势，在２．５ｈ时清除率最低；水解时间在３．Ｏｈ后，自由基清除率无显著差异（各相邻点间ｐ＞Ｏ．０１）。因此，可以认为在水解３ｈ后，水解时间对酶解液ＤＰＰＨ自由基淬灭能力无显著性影响。ＡＢＴＳ自由基淬灭能力（蛋白浓度０．２ｍｇ／ｍＬ）在水解时间４ｈ前变化不显著，４．０ｈ后淬灭能力呈下降趋势。超氧阴离子淬灭能力（蛋白浓度１０ｍｇ／ｍＬ）在水解时间２．５ｈ和４．２ｈ时出现最大值，在水解时间３．１ｈ时出现最小值。在水解开始时酶解物中水解度很低，可溶性蛋白含量较低，用三氯甲烷脱色后的残存色素含量相对较高，对ＤＰＰＨ自由基淬灭能力有较大的影响。不考虑２．５ｈ内色素对ＤＰＰＨ自由基淬灭能力有较大影响，４ｈ水解物有较高的总体抗氧化活性。另据ＹｏｕｌｉｎｇＸｉｏｎｇ［５】将玉米蛋白水解物添加入脂质体系测定ＰＯＶ值和ＴＢＡＲＳ值，结果发现４ｈ水解物对脂质体系腐败有较好的抑制效果。徐力【２８】报道，玉米蛋白水解４ｈ时水解液螯合Ｃｕ２＋能力、邻苯三酚自氧化能力最强。本文采用的玉米醇溶蛋白含量高达９２％，其水溶性比较差，水解２．５ｈ时水解液有蛋白悬浮颗粒，停止搅拌仍会出现结团沉淀现象。１６第二章抗氧化性玉米蛋白的制备综上结果，本实验在后续实验中，将选择水解时间为４ｈ（ＤＨ＝２１．７％）作为制备具有抗氧化性的玉米蛋白水解物，该水解物总体抗氧化活性较高。２．３．４玉米蛋白水解物的分子量以及分子量分布玉米蛋白在碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ水解时间为４ｈ（ＤＨ＝２１．７％）时，产物具有较好的综合抗氧化性。本实验采用高效液相色谱法测定该水解产物的分子量以及分子量分布，以确定该产物的特征。４．４４．１３．８３．５乐昌—害３．２２．９２．６２．３２１２１４１６Ｒｃｔｉｏｎ１８２０２ＺＴｉａｃ／ｒａｉｎ图２．５分子量分布标准曲线Ｆｉ９２－５Ｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ图２．５为采用ＴＳＫｇｅｌ２０００色谱柱将细胞色素Ｃ、杆菌酶、乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸和乙氨酸一乙氨酸一乙氨四种标准品上样Ｗａｔｅｒｓ６００高效液相色谱仪，经ＷａｔｅｒｓＭ３２ＧＰＣ软件处理得分子量分布标准曲线。１７江南大学硕士学位论文．Ｍｉｎｕｔｅｓ图２－６玉米蛋白水解物的分子量分布图Ｆｉ９２－６Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ玉米蛋白４ｈ水解物采用ＴＳＫｇｅｌ２０００色谱柱，经ＷａｔｅｒｓＭ３２ＧＰＣ软件处理得玉米蛋白水解物分子量分布图２．６和分子量分布表２．３。表２．３玉米蛋白水解物的分子量分布分布表Ｔａｂｌｅ２－３Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｈｙｄｒｏｌｙｓｔｅ（４ｈ）如图２－６和表２．３所示，玉米醇溶蛋白水解４ｈ时玉米肽分子量主要集中在２００Ｄａ＇－－＂９００Ｄａ，此分子量区域的肽段占总量的９０％以上。２．４本章小结本章主要研究具有良好抗氧化性的玉米蛋白质水解物的制备方法。结果显示：（１）利用三氯甲烷对玉米蛋白水解物进行脱色后进一步采用Ｃ１８反相填料色谱脱色，可以很好脱除玉米蛋白水解物中的色素。（２）采用碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ，在ｐＨ９．０、５０℃下水解玉米蛋白（３０ｇ／Ｌ）４ｈ时，水解度达２１．６％，而且此水解物整体抗氧化性比较好，１０ｍｇ／ｍＬ水解物的ＤＰＰＨ自由基１８第二章抗氧化性苄米蛋白的制备清除率为３５．７％，ＡＢＴＳ自由基清除率为５８．Ｏ％，超氧阴离子清除率为１１．１％；经高效液相色谱测定水解物的分子量分布，结果表明玉米肽分子量主要集中在２００Ｄａ～９００Ｄａ，此分子量区域的肽段占总量的９０％以上。１９江南大学硕士学位论文第三章玉米水解物组成与其抗氧化相关性３．１引言前一章的研究结果表明，随着玉米蛋白水解度的变化，水解物的抗氧化活性也改变，玉米蛋白水解物的抗氧化活性是该水解物中各个组分抗氧化活性的综合。因此研究玉米蛋白水解物组成与其抗氧化活性之间的相关性，对阐明玉米肽抗氧化机理有着重要意义，对玉米蛋白的充分利用也有着现实意义。本章从玉米蛋白水解物的分子量、分子量分布以及极性等性质出发，采用超滤、凝胶层析以及反相高效液相色谱的分离纯化手段制备抗氧化性玉米肽，并对分离产物进行抗氧化性实验，试图从多个角度探讨玉米蛋白水解物体系中的不同组分与抗氧化能力的相关性。３．２实验材料和方法３．２．１实验材料ＤＰＰＨＡＢＴＳＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ甲醇（色谱纯）江苏汉邦科技有限公司自制均为分析纯超纯水其它试剂３．２．２实验仪器ＬＣ．２０Ａ高效液相色谱仪Ｗａｔｅｒｓ．１５２５高效液相色谱仪日本ＳｈｉｍａｄＺＨ公司美国ＷＡＴＥＲＳ公司ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；上海赛鸽电子科技有限公司美国ＶＡＲＩＡＮ公司上海亚荣生化仪器厂梅特勒一托利多仪器仪器有限公司梅特勒一托利多仪器仪器有限公司Ｐｅｌｌｉｃｏｎ．２超滤系统ＳｕｐｅｒｐｕｒｅＷａｔｅｒＳｙｓｔｅｍＣａｒｙ一５０紫外探头型可见光谱仪Ｒ一５０１Ｂ真空旋转蒸发装置ＤＥＬＴＡ３２０酸度计ＰＬ．２００２电子天平ＴＧＬ．１６Ｇ高速离心机．Ｚ系列层析柱（①１．６ｘ１２０ｃｍ）上海安亭科学仪器厂无锡旭野有限公司上海沪西分析仪器厂．ＨＤ．３紫外检测仪ＸＷＴ．Ｓ小型台式记录仪上海自动化仪器三厂上海沪西分析仪器有限公司上海沪西分析仪器有限公司ＨＬ．１恒流泵ＢＳＺ．１００自动部分收集器２０

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