抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(4)

第二章抗氧化性玉米蛋白的制备Ａ０１．５ｍＬＤＰＰＨ无水乙醇溶液（Ｏ．１ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）＋１．５ｍＬ样品的溶剂Ａ１１．５ｍＬＤＰＰＨ无水乙醇溶液（Ｏ．１ｍｍｏｌ／Ｌ）＋１．５ｍＬ样品Ａ２１．５ｍＬ无水乙醇溶液＋１．５ｍＬ样品充分荡使其溶解于室温下反应３０ｍｉｎ，用分光光度计在５１７ｎｍ下；溅ＪＯＤ值清除率（％）＝［１一（Ａｌ－－Ａ２）／Ａ０］ｘ１００％２．２．７．２ＡＢＴＳ自由基清除法参考Ｍｉｌｌｅｒ的等人发表的文献１３引。其主要原理是：该方法是以ＡＢＴＳ（２，２’．Ａｚｉｎｏ．ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ．６．ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍｓａｌｔ）水溶性的自由基引发剂为显色剂，ＡＢＴＳ经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ＡＢＴＳ＋，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ＡＢＴＳ＋．发生反应而使反应体系褪色，６ｍｉｎ后在７３４ｎｍ下检测吸光值（Ａ７３４）的变化。试剂配置：ＰＢＳ溶液：称取８９ＮａＣｌ、０．２９ＫＣｌ、１．４４９Ｎａ２ＨＰ０４和０．２４９ＫＨ２Ｐ０４，调ｐＨ６．８并定溶至１０００ｍＬ。ＡＢＴＳ＋．：５ｍＬ的７ｍｍｏｌ／ＬＡＢＴＳ和８８Ｉ．ｔＬ的１４０ｍｍｏｌ／Ｌ高硫酸钾，在室温下避光静置过夜，形成ＡＢＴＳ自由基储备液，使用前用ＰＢＳ稀释至Ａ７３４＝Ｏ．７００－ａ：０．００２。测定方法：取４ｍｌ的ＡＢＴＳ＋．工作液＿１ｍＬ抗氧化肽＿混合１０ｓ－－’２５。Ｃ静置６ｍｉｎ＿在７３４ｎｍ处测定吸光值。２．２．７．３邻苯三酚自氧化法参考张强㈣和汪建斌例发表的文献。其主要原理是：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化释放出０２‘，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿色，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。邻苯三酚自氧化过程的初始阶段，中间物的积累在滞留３０ｓ．５５ｓ后，与时间成线性关系，一般线性关系维持在４ｍｉｎ的范围内。经实验证明，中间物在３２０ｎｍ波长处有强烈光吸收。当有类似超氧化物歧化酶的抗氧化活性物质存在时，能催化０２。与一结合生成０２和Ｈ２０２，从而阻止了中间产物的积累。因此，通过计算就可求出抗氧化活性。试剂的配制（１）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ－ＥＤＴＡ缓冲液：Ｔｒｉｓ１．２１１４９，ＥＤＴＡ１１６．９ｍｇ，力Ｈ８０ｍＬ双蒸水，用０．２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ＝８．２士Ｏ．１，最后用双蒸水定容到１００ｍＬ。（２）ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ：用０．１ｍｏｌ／Ｌ的标准ＨＣｌ配制成ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ。（３）１０ｍｍｏｌ／Ｌ的邻苯三酚（ＰＲ）：取３１．５２７５ｍｇＰＲ用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶解定容到２５ｍＬ。测定方法：按表２．２所示在试管中加入Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ缓冲液和超纯水，并将邻苯三酚一起在２５＂（２下水浴孵育１０ｍｉｎ后，将邻苯三酚加入试管迅速摇匀并倾入比色杯中，０．５ｍｉｎ后在３２０ｒｉｍ波长扫描４ｍｉｎ，求出邻苯三酚自氧化速率（Ｏ．６Ａ／ｍｉｎ），用抗氧化肽替换江南大学硕士学位论文超纯水测定抗氧化肽的超氧阴离子淬灭能力。表２．２超氧阴离子清除法实验步骤Ｔａｂｌｅ２－２ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｔｅｐｏｆＰｙｒｏｇａｌｌｏｌＡｕｔｏｏｘｉｄａｔｉｏｎｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙＰＲ抑制率（Ｉ）按照下式计算：Ｉ＝（△Ａｏ一△ＡＩ）／△Ａｏｘｌ００％其中△Ａｌ：加样品液后ＰＲ的自氧化速率２－３ＡＡｏ：未加样品液的ＰＲ自氧化速率２．２．８玉米蛋白水解物分子量分布的测定采用高效液相色谱法测定玉米蛋白水解物的分子量分布。１．标准曲线的制作将ＴＳＫｇｅｌ２０００色谱柱（０７．８ｘ３００ｍｍ）接入Ｗａｔｅｒｓ６００高效液相色谱仪，采用Ｗａｔｅｒｓ２４８７紫外检测器，对样品进行分离检测，数据处理及计算由ＷａｔｅｒｓＭ３２ＧＰＣ软件自动进行。色谱条件为流动相：乙腈／水仨氟乙酸（４５／５５／０．１（ＶⅣⅣ））；流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；柱温：３０℃；检测波长：２２０ｎｍ。分子量校正曲线所用标准品：细胞色素Ｃ（ＭＷ１２５００）；杆菌酶（ＭＷ２．玉米蛋白水解物分子量分布的测定在相同的色谱条件下进样，数据ＷａｔｅｒｓＭ３２ＧＰＣ软件处理和计算得水晶水解物分子量的分布。１４５０）；乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸（ＭＷ４５１）；乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸（ＭＷ１８９）。２．２．９高效液相色谱分析实验参照张晓峰【５６１、孙彦吲等文献方法。将ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ１８柱接入ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ．２０Ａ系统，采用ＳＰＤ．Ｍ２０Ａ检测器，用甲醇进行梯度洗脱。色谱条件为柱温：３５℃；短肽浓度：ｌＯｍｇ／ｍＬ；上样量：５１．ｔＬ；检测波长：２８０ｎｍ、２２０ｎｎｌ；流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ：甲醇（色谱纯）；流动相Ｂ：５％（ｖ／ｖ）甲醇＋０．２％甲酸；洗脱梯度：（Ｏ一１００％Ａ）／３０ｍｉｎ。２．３结果与讨论２．３．１玉米黄色素等杂质的脱除本实验采用的玉米醇溶蛋白尽管纯度超过９０％，但是依然呈现淡黄色，含有玉米黄色素。该色素属于类胡萝卜素，为异戊二烯类，是以ｐ．胡萝卜素（极性较弱）、玉米黄素（３，３’．二羟基．ｐ．胡萝卜素）、隐黄素（３．羟基．ｐ．胡萝ｂ素）和叶黄素为主要组成的类１２墨三兰堕墨些丝兰鲞至鱼箜型鱼胡萝卜素的混合物【ｌ５１。水解物中黄色素首先容易对微滤膜和超滤膜造成堵塞，对玉米肽的分离造成不利的影响；其次类胡萝卜素具有高效淬灭单线态氧和自由基的作用，会对肽抗氧化性的研究带来很大的干扰。因此在实验过程中尽量降低水解物中玉米黄色素的残留。玉米黄色素具有亲脂性，易溶于有机溶剂，难溶于水，本实验采用了三种方法以除去色素等杂质，实验结果如下。方法一对玉米醇溶蛋白粉采用有机试剂超声萃取的方法，结果如图２．１所示。２１１８１５１２９６３０１２３哇５６７萃取次数／次团乙酸乙酯萃取液一丙酮和石油醚萃取液图２－１有机溶剂对玉米蛋白的脱色效果Ｆｉｇ２－１Ｔｈｅｄｅｃｏｌｏｒｅｆｆｅｃｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｏｎｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎ对玉米蛋白粉首先用乙酸乙酯去除色素等杂质，然后用不同极性的丙酮／石油醚＝３／７（Ｖ／Ｖ）混合溶剂萃取极性较大或较小的色素。统计分析显示，这种有机试剂萃取组合有很好的脱色效果。但脱色后的玉米蛋白粉仍呈现一定的浅黄色，其水解物也呈现浅黄色，说明该方法脱色不完全。方法二首先对玉米醇溶蛋白进行水解，将水解液用等体积的三氯甲烷反复脱色。采用该方法对玉米蛋白水解物脱色后，水解液呈现淡黄色，说明该方法脱色同样不完全。方法三将玉米蛋白水解物中分子量为Ｏ．１０００的肽段通过Ｃ１８反相填料柱吸附黄色素。结果表明Ｃ１８反相填料柱可以很好的吸附色素，５０％甲醇溶液可从Ｃ１８反相填料柱上系脱掉黄色素。将Ｏ．１０００的肽段在脱色前样品和水洗脱液样品在相同浓度下经高效液相色谱分析，结果如图２．２（参照附录图３）。江南大学硕士学位论文图２－２Ａ２２０ｎｍ水解物脱色前色谱图Ｆｉ９２—２ＡＴｈｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｂｅｆｏｒｅｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎａｔ２２０ｎｍ图２－２Ｂ２２０ｎｍ水解物脱色后色谱图Ｆｉ９２－２ＢＴｈｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｆｔｅｒｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎａｔ２２０ｎｍ图２．２是Ｏ．１０００的肽段经ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ１８柱检测波长为２２０ｎｍ下色谱图。从图中可以看出在洗脱时间为１５．Ｏｍｉｎ时色谱峰变小或者消失，２０ｍｉｎ时色谱峰完全消失。１５．０ｒａｉｎ时洗脱液为５０％甲醇，与‰５反应色素洗脱一致，从１５．０ｍｉｎ开始色素从Ｃ１８反相填料柱上逐渐被洗脱出来。但是由于色素和非极性肽段极性几乎处于相同区间，导致部分非极性玉米肽的损失。１４第二苹抗氧化性玉米蛋白的制备总之，方法一采用不同极性的有机溶剂萃取玉米蛋白原料中的色素，脱色效果很好，但脱色并不完全，而且操作繁琐。本实验采用方法二和方法三结合的方法进行脱色。对４ｈ玉米蛋白酶解物采用方法二初步去除色素等杂质，进一步对超滤得到分子量小于１０００的肽段采用方法三脱色，可以彻底的除掉色素，在反相高效液相制备中将色素抗氧化的影响降到最低。２．３．２水解过程中水解度的变化玉米醇溶蛋白是分子量约２１０００．２７０００Ｄａ，主要分为Ｏ【一玉米醇溶蛋白质（分子量２５０００Ｄａ）和１３．玉米醇溶蛋白质（分子量２１０００Ｄａ）两种，分别占醇溶蛋白８０％和２０％，前者溶于９５％的酒精、后者不溶于９５％的酒精，而溶解于６０％酒精。玉米醇溶蛋白中高比例的非极性氨基酸、缺少碱性及酸性氨基酸和氢键、疏水键、二硫键等的相互作用的特点，导致分子中存在较大区域的０【．螺旋结构。蛋白分子的立体结构导致其疏水性很强，难溶于水而微溶于酸碱溶液【６０。６２１。本实验选择碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ作为水解酶，因为它水解蛋白时对肽键的特异性不强，有助于水解。水解过程采用碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ，酶用量２％（Ｅ／Ｓ），底物玉米蛋白悬浮液固形物含量为３％，水解温度为５０℃，ｐＨ＝９．０。用不同水解时间消耗的碱量计算水解度ＤＨ，在水解过程中考察水解时间对ＤＨ和可溶性蛋白浓度的影响。２５．２３２１１９、永刨琏＊１１９７５０．５１１－５２２．５３３．５４４．５５５．５水解时间／ｈ图２－３水解时间对玉米蛋白水解度的影响Ｆｉ９２—３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅｏｉｌＤＨｏｆｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎ水解反应开始时，碱性Ａｌｃａｌａｓｅ以较高较稳定的速率水解玉米蛋白，水解２ｈ后水解速率开始减小，４．５ｈ后时水解速率趋于零。５．５ｈ后添加碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ，水解速率没有显著性变化。１５

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