流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术(3)

的温度可以相差1度至24度。最高的温度为105度，最低可为30度。点击Gradient(梯度)按纽可在程序中插入一个梯度步骤。

最左边一列（Column 1）是温度梯度的低温，其设定值应在30-104度之间。在我们例子中，Set temperature to 一栏中，L=55。最右边一列（Column 12）是温度梯度的高温，其设定值应在31-105度之间。在我们例子中，R=65。最左边一列与最右边一列的最小温差为1度，最大为24度。在输入完温度梯度的范围之后，还要在Maintain for(保温时间)一栏中输入保温时间。可以通过点击时：分：秒并输入一个时间，也可用滚动条来选择，如例子中的第二步的00：00：30度。.你也可以选择Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义的一段时间。

如果不再作修改，点击Insert(插入)，将步骤加到程序中。梯度步骤将在程序显示窗口中显示为第2步。注意，此时加黑的步骤又是END，这表明，下一个插入的步骤是在END之前，第2步之后。在将梯度步骤插入程序中之间，你还可以选择Extend Time选项（参见”温度”一节对这些选项的解释）。梯度计算器要了解梯度保温时每一列精确的温度，可点击Tool（工具）菜单，并选择Gradient Calculator(梯度计算器)。

请注意温度梯度并不是线性的，中间孔的温度间隔较大。这是模块下的加热器的结构造成的。每个孔的温度都非常精确。温度梯度所得到的结果可以在随后的非梯度程序中得到很好的结果。读板步骤插入一个读板步骤可以指示Opticon 2检测器对样品、定量标准及空白孔进行荧光测定。读板在上一个保温步骤完成之后立即进行，如举例中的第2步。读板在当前的保温温度下完成，然后才开始下一步，如举例中的第4步。要插入一个读板步骤，请点击Plate Read(读板)按纽，读板步骤就会插入到程序中。在我们例子中，读板步骤显示为第3步，在简图中，读板用一个眼型的图标来表示。

增加多个温度步骤、梯度步骤和读板步骤要增加多个温度步骤、梯度步骤和读板步骤，可按适当的按纽，并按照以下步骤的指导进行。在我们的例子中，第4步是72度保温00:01:00，没有其他选项。循环步骤循环步骤的目的是让许多重复的步骤不必一步一步的输入和显示。当程序运行到循环步骤时，程序又回到指定的某一步，并运行这一步到循环步骤之间所有步骤。当循环进行了指定的次数之后，程序进行到循环步骤的下一步。在我们的举例中，第5步是回到第1步的循环步骤。再重复第1-4步24次，总共是25次，然后进行第6步。这些都包含在了一个循环步骤之中。

点击Goto(循环)按纽，输入程序返回的步骤号。在我们的例子中，Goto栏中输入的是1，How Many More Times?一栏中输入的是24。这个第5步将指导程序在进入第6步之前，重复1-4步共24次。点击Insert(插入)按纽，将循环步骤加入程序中去。

解链曲线步骤：

解链曲线可用来确定特定的片段以及分析产物的均一性。解链曲线图受到很多因素的影响，其中包括产物的数量和浓度、片段的长度和G+C含量以及其他一些影响核酸变性温度的因素，如缓冲液等。要进行解链曲线步骤，可点击Melting Curve(解链曲线)按纽。

输入一个Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一个Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。在我们的例子中，开始和结束温度分别为55度和90度。另外，还要在进行解链曲线步骤期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一个温度（0.1-10.0度）来确定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads一栏输入一个时间（1秒-1小时）来确定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。一般推荐温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。点击Insert（插入）按纽将解链曲线步骤增加到程序中。每个程序中只能有一个解链曲线步骤。

编辑某一步骤要想编辑程序的某一步骤，首先点击程序显示窗口中的这一个步骤，使其加深，然后点击Edit Step（编辑步骤）按纽。此步骤的各种参数就会显示出来，修改成你想要的之后，点击Replace(替换)按纽将编辑后的步骤加入程序中，也可点击Cancel(取消)按纽来取消这次编辑。删除某一步骤要想删除程序的某一步骤，首先点击程序显示窗口中的这一个步骤，使其加深，然后点击Delete（删除）按纽将此步骤从程序中删除。剩余的程序各步骤会自动重新编号。在已有步骤中插入一个步骤要想在已有步骤中插入一个步骤，首先在程序显示窗

口中点击想要插入新步骤的后一个步骤，使其加深。所有加入的步骤都在此步骤之前。然后点击相应的按纽来插入你想插入的步骤。当你输完所有的程序文件参数之后，点击程序文件窗口左上角的OK按纽来保存程序文件，并回到主文件窗口。主文件的程序设计一节会显示程序的简图、总的读板次数、解链曲线以及大约的运行时间。点击Cancel（取消）按纽也可以不保存程序文件并回到主文件窗口。融解曲线分析融解曲线可用来鉴别特异性片段或评估样品的同质性。融解曲线图受到

多种因素的影响，如片段的浓度与数量、每个片段的长度及G+C含量，还有其他因素如缓冲液的条件等都会影响核酸的融解温度。Opticon 2 可以自动完成融解曲线。这一分析可用于多种用途，包括恒温试验、区分片段大小，利用Opticon 2 的96个样品的能力来完成高通量的终点分析。要完成一个与循环无关的融解曲线分析，点击Melting Curve 按纽。

输入一个Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一个Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。另外，还要在进行解链曲线步骤期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一个温度（0.1-10.0度）来确定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads一栏输入一个时间（1秒-1小时）来确定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。一般推荐

温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。

点击Insert 按纽来增加一个融解曲线步骤到程序中。每个程序只能有一个融解曲线分析步骤。

保存一个程序文件要保存一个新生成的程序文件，从主文件窗口的程序设计一节中选Save按纽。在保存窗口的File name一栏中输入一个合适的名字。点击Save按纽就可保存为.prot文件了。

当然仅仅这些是远远不够的，还需要做的事情还有很多...以上总结仅仅适合我们的试剂和仪器。仪器使用说明见附件

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