流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术(2)

溶解前4℃保存，溶解后-20℃或以下保存。

3、反应体系的配制：

试剂盒中取出所需试剂，在室温下融化后，4000r/min离心30s，配制反应体系：

无RNA酶水（Rnase Free Water) 每反应5μl

2×RT-PCR Buffer 每反应12.5μl 上游引物 每反应0.5μl 下游引物 每反应0.5μl 探针 每反应0.5μl 25×RT-PCR Enzyme Mix 每反应1μl

充分混合均匀，向每个PCR管（指定仪器专用）中每支各分20ul，转移至样本处理区。

三．加样 （在样本处理区进行） 领回的阳性RNA-20℃保存，5倍稀释使用。

在各设定的PCR管（指定仪器专用）中每支分别加入提取的样品RNA溶液以及阴、阳性对照各5ul，盖紧管盖后，4000r/min离心30s。 四．荧光RT-PCR反应 （在检测区进行）

1．将装有反应体系和样品RNA的PCR反应管放入荧光PCR检测仪内 2．循环条件设置

a) _50_℃ __30__min

b) _95_℃ __10__min c) _95_℃ __15__sec

d) _55_℃ _31__sec (注：荧光收集设置在此步进行) e) 从第c)步（_95_℃ __15__Sec）开始循环__44___周期

五.结果判定

1.结果分析条件设定

反应结束后，自动保存检测数据文件，调节噪音基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，读取结果。 2．结果描述及判定原则

在质控标准有效地情况下进行结果判断：阴性对照的检测结果阴性；阳性对照的Ct值

≤28.0。否则此次实验视为无效。

根据Ct值判断结果，Ct值无数值的样本为阴性样本。Ct值≤40.0的样本为阳性样本； Ct值＞37.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。 六、输入新程序：

生成程序文件程序文件包含一个程序，这个程序控制热循环仪运行参数，定制什么时候Opticon 2检测器对分配有样品、定量标准及空白孔中的荧光进行测定。程序的步骤可以在程序文件窗口中进行输入和编辑，并有一个列表和一个简图来显示各个步骤。按主文件中Protocol Setup一节的New按纽可以生成一个新的程序文件。

选择温度和热盖控制模式点击温度和热盖模式一栏的Set Modes(设定模式)按纽，来显示热

盖模式窗口，你可以定制运行时所使用的温度控制方法（Control Method）及热盖控制(Lid Control)方法。

温度控制方法DNA Engine Opticon 2可用两种不同的方法来控制模块的温度，每一种方法可会影响样品加热的速度和精确度。

1、计算控制是默认的温度控制方式。它是大多数程序所选用的方式，它一致性好，快速而且可靠。在使用计算控制方式时，DNA Engine Opticon 2根据模板的温度、样品管的传热速度以及样品的体积来估计样品的温度。由于这一估计是基于已知量及热传导的规则，因此样品温度的控制比模块温度控制方式更精确。

使用计算控制方式可以明显缩短程序运行的时间。此外，还有利于保持酶的活性及降低引物错配。在计算控制方式下，变性时间一般为5-30秒，复性和延伸温度也可以减少，但其时间长短因反应的不同而不同。

计算控制方式通过以下三个方面来缩短程序：

?8?5 通过短而精确的模板温度过高来快速地提高样品温度

?8?5 根据样品而不是模块达到目的温度的时间来确定保温时间

?8?5 仪器根据容器的型号及反应液的体积来自动进行补偿

2、在模块控制方式中，DNA Engine Opticon 2系统根据程序来控制模块的温度，而不是样品的温度。在控制样品实际温度方面，模块控制方式的精确性比计算控制方式要差。在模块控制方式中，样品温度始终落后于模块的温度。落后时间的长短与容器的型号及反应液的体积有关，一般在10-30秒之间。模块控制方式一般用于运行由其他模块控制方式的热循环仪得来的程序，如MJ Research公司的PTC-100循环仪及PTC-150型循环仪。

热盖控制当样品被加热后，水汽会向上蒸发，积到管盖或平板盖上。这会造成样品体积、反应物浓度以及酶学反应动力学的改变。使用热盖可以使反应容器上部的温度比反应液温度高，从而减少水份的蒸发。DNA Engine Opticon 2系统有三种控制热盖的方式：Constant(恒

定)、Tracking(追踪)或Off(关闭)。

?8?5 Constant(恒定)：维持热盖一个特定的温度。要使用恒定热盖温度控制方式，可选择Constant(恒定)，并输入30度到110度之间的一个温度或用箭头滚到想要的温度。一般推荐比程序中最高温度高5-15度。你还可以设定一个样品-模块温度，当热盖温度低于此温度时，热盖就会关闭。在Lid Shutoff Temperature(热盖关闭温度)中输入一个1度至50度的温度，或用箭头滚到想要的温度。

?8?5 Tracking(追踪)：设定热盖的温度比样品模块的温度略高。这一方式对于在30-70度之间长时间保温的程序来讲是有用的，从而不必将热盖温度一直保持在较高的温度下。一般设定比模块的温度高5度。要使用恒定追踪温度控制方式，可选择Tracking(追踪)，在Lid Temperature=Block Temperature +(热盖温度=模块温度+)一栏中输入1度到45度之间的一个温度，使得热盖温度保持比模块温度高。要定制样品-模板温度低于一定温度时，热盖自动关闭，可在Lid Shutoff(热盖并闭)中输入1-50度之间的一个温度或用鼠标箭头来滚动选择。 注意：由于热盖没有降温的能力，因此在模块温度变化较快时，热盖温度的变化是跟不上模块的。由于热盖质量较大，其加热的速度也比模块要慢。

?8?5 Off（关闭）：不给热盖提供电源。在这模式中，样品会发生浓缩，其速率与保温的温度及所用的管或板的密闭剂类型相关。只有在使用油或石蜡封口时才能使用此选项。 点击OK将温度和热盖控制的设定应用到程序中，也可选Cancel(取消)来关闭此窗口而不改变程序所用的设定。这一设定将出现在程序列表和图形显示上方的Control and Lid Settings区域中。设计和输入程序本节将举一个程序的例子并介绍如何输入程序的步骤，另外还介绍程序的选项。举例如下： 1、94度保温30秒；

2、复性温度为温度梯度，在12列中从55度到65度； 3、读空白、定量标准及样品孔的荧光强度； 4、72度保温一分钟；

5、重复1-4的步骤，增加24次，然后进入第6步；

6、通过解链曲线来检测反应产物的纯度，具体步骤为：从55度升温到90度，温度每升高1度，测定荧光强度10秒；

7、结束程序 输入新程序：

当你向程序中输入一个步骤后，该步骤的描述就会出现在上部的程序显示窗口中，同时下部也会出现一个图示来说明此步骤的温度和时间。使用水平缩放滑块和滚动条可更清楚地观看程序简图。在输入一个新程序前，可以看到显示窗口上方有一个加深了的END（结束）步骤。Opticon 2监控软件中，所加入的步骤都在加深了的步骤之前。 温度步骤温度步骤确定保温的温度和时间长短。如果不在程序中另处设定升降温的速度，DNA Engine Opticon 2系统将以最快的速度达到此温度（参见本节最后的”Manual Ramp Rate”）。点击Temperature(温度)按纽进入保温步骤（如举例中的第1步和第4步）。

在Set Temperature to(设定温度为)一栏中输入一个0-105度之间的温度，也可用滚动条来选择，如例子中的第一步是94度。在Maintain For(保温时间)一栏中输入保温时间，最长可到18小时。点击时：分：秒并输入一个时间，也可用滚动条来选择，如例子中第一步的00：00：30。.你也可以选择Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义的一段时间。一般用于程序完成后将样品保存在较低温度中，推荐为10度。在简图中永久保存表示为∞。 如不再作修改，点击Insert(插入)，将温度步骤加到程序中。此步骤立即在上部的程序显示窗口和下部的简图中出现。注意，此时加黑的步骤又是END，这表明，下一个插入的步骤是在END之前，第一步之后。在将步骤插入到程序中之前，你还可以通过选项来对温度步骤进行修饰，可修饰的选项包括：

1、Manual Ramp Rate(升降温速率)：设定一个比最高速率低的升降温速率。可在0.1-2.5度每秒之间进行设定。保温步骤之间的快速升降温可以节约总的反应时间10％-30％，并有利于降低非特异性扩增产物。

2、Increment Temperature(增加或降低温度)：修改温度步骤，使得每个循环增加或降低一定的温度（0.1-10度/循环）。这一办法一般用于复性这一步。

在复性时，复性温度从比计算的温度高一些开始，然后每个循环逐步降低，达到甚至低于计算温度。这种复性温度由高到低的策略有利于在循环早期得到较理想的扩增产物。 3、Extend Time(延长或缩短时间)：修改温度步骤，使得每个循环延长或缩短保温时间（1-60秒/循环）。

此方法一般用于延伸步骤中慢慢增加延伸时间（一般为2-5秒/循环）。在反应的最后几个循环中，由于酶活性的减少和模板分子数的增加，在延伸期间，每个酶分子所在合成的碱基数量大大增加，因此延长延伸时间有利用延伸更完全。

4、Beep When Completed(完成时发出嘟嘟声)：当目的温度达到时，机器发出嘟嘟声。梯度步骤温度梯度功能可以使你同时优化几个不同变性或复性温度。从左到右，96孔样品模块

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