流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术

流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术

实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。

一、实时荧光定量PCR原理： 1、SYBR Green法：

SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。

2、TaqMan法：

在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq酶的5‘ →3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。 3、分子信标法：

探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。

流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。

二、试剂 器材 设备和器械

咽拭子液的配制：一瓶MEM液500ml，+8万单位庆大1.25ml，分装在5ml小管中，每管4ml。小管最好高压。

1、RNA提取试剂盒 荧光PCR检测试剂盒

提取试剂盒组分：洗脱液（Elution Buffer）、载体核酸（Carrier RNA）、裂解结合增强液（Lysis/Binding Enhance）、裂解/结合液（Lysis/Binding Soln）、磁珠（RNA Binding Beads）、洗涤液1（Wash Soln 1）、洗涤液2（Wash Soln 2）

荧光PCR检测试剂盒组分：2×RT-PCR反应液（2×RT-PCR Buffer）、25×RT-PCR酶混合液（25×RT-PCR Enzyme Mix）、高G/C含量引物/探针检测增强剂（ Detection Enhancer）、无核酸降解酶的水（Nuclease-free Water）

无水乙醇 无水异丙醇

2、生物安全柜 移液器 微型离心机 微型漩涡式混合器 微型离心管 PCR管 冷冻盒 带滤头吸头 低温冰箱 U型样品处理板 96孔磁力板 三、操作步骤

一．样本的处理 （在样本处理区进行）

根据咽拭子标本数，计算好所需配制的裂解液和磁珠混合液的量，即待测样本数+阴性对照+甲型对照+乙型对照+ 一个样本量为损耗。需要配制的液体仅仅是洗液：洗液1：向Wash Soln Conc. 1瓶中加入12毫升无水异丙醇（100%）。摇匀后室温保存；洗液2：向Wash Soln Conc. 2瓶中加入32毫升无水乙醇（100%）。摇匀后室温保存。将含拭子的转运液震荡2分钟，取50微升上清液进行核酸抽提。剩余溶液-80℃保存。

1. 配制裂解/结合液

每反应1ul Carrier RNA，每反应65ul Lysis/Binging Conc.,每反应65ul 无水异丙醇。摇匀后室温保存备用。

2. 配制磁珠混合液

每反应10ul Lysis/Binging Enhance，每反应10ul RNA binding Beads。混匀后4℃保存备用。 3. 裂解/ 结合

U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预处理后的样品、130ul裂解/ 结合液。漩涡振荡器上轻微振荡5分钟，完成溶液混匀和核酸结合。将U型板移至96孔磁力板上，静置3分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液。 4. 洗涤液1洗涤2次：

将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液1，漩涡振荡30秒

将U型板移至96孔磁力板上，静置2分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液

用150微升洗涤液1再洗涤一次。尽量吸干上清液。 5. 洗涤液2洗涤2次

将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液2，漩涡振荡30秒

将U型板移至96孔磁力板上，静置1分钟。将U型板保持在磁力板上，移去上清液

用150微升洗涤液2再洗涤一次。尽量吸干上清液 6. 洗脱

将U型板从磁力板上拿下，漩涡振荡2分钟让剩余溶液挥发。 加入50微升Elution Buffer, 漩涡振荡3分钟。

将U型板移至96孔磁力板上，静置4分钟。纯化的核酸在上清液中，可直接用于PCR或转入干净的离心管中-20℃ 储存。

二．扩增试剂准备与配置 （在反应混合物配制区进行）

1、引物介绍（不全，待续）：

引物名称 碱基组成 FluA-Forward 5’—GAC CRA TCC TGT CAC CTC 甲型流感病TGA C—3’ 毒的通用引物，包括季FluA-Reverse 5’—GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G—3’ 节流感和禽流感也可环15’—TGC AGT CCT CGC TCA CTG FluA-probe GGC ACG —3’ 境标本检测 Flu B Forward 5’-TCC TCA ACT CAC TCT TCG B NS 乙型流感病AGC G-3’ 毒的通用引Flu B Reverse 5’-CGG TGC TCT TGA CCA AAT 物 TGG-3’ 15’-CCA ATT CGA GCA GCT GAA Flu B probe ACT GCG GTG-3’ AH1 Forward 5’-AAC TAC TAC TGG ACT CTR CTK GAA H1 HA 季节性流感-3’ 病毒H1亚AH1 Reverse 5’-CCA TTG GTG CAT TTG AGK TGA TG-3’ 型鉴定引物 AH1 Probe 2检测基因 A M 检测目的 5’-TGA YCC AAA GCC ”T”CT ACT CAG TGC GAA AGC 3-’ AH3 Forward 5’-AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC -3’ H3 HA 季节性流感AH3 Reverse 5’-ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT-3’ 病毒H3亚AH3 Probe 15’-CAG GAT CAC ATA TGG GSC CTG TCC CAG-3’ 型鉴定引物 H5 HA 禽流感病毒H5亚型鉴定引物 AH5a Forward 5’—TGG AAA GTR TAA RAA ACG GAA CGT —3’ AH5a Reverse 5’—YGC TAG GGA RCT CGC CAC TG —3’ 1 5’—TAC CCG CAG TAT TCA GAA H5HA-probe GAA GC—3’ Swinfa 5’-GCA CGG TCA GCA CTT ATY Forward CTR AG-3’ Swinfa reverse 5’-GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC-3’ 25’-CYA CTG CAA GCC CA”T” ACA Swinfa probe CAC AAG CAG GCA-3’ SWH1 forward 5’-GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA-3’ SWH1 reverse 5’-CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC-3’ SWH1 NP 所有猪流感A病毒鉴定引物 SWH1 HA 猪H1流感病毒 5’-CA GAA TAT ACA “T”CC RGT SWH1 probe CAC AAT TGG ARA A-5’ RNP-Forward 5’ —AGA TTT GGA CCT GCG AGC G—3’ RNP-Reverse 5’ —GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT—3’ 15’ —TTC TGA CCT GAA GGC TCT RNP-probe GCG CG—3 2RNP 内参基因，用于检测人源标本，且基因检测结果必为阳性，否则说明采样不合格或核酸提取失败。用于季节性流感、人禽流感病例检测

2、甲型H1N1流感病毒及其它流感病毒Real-time PCR引物和探针稀释方法：

1．引物工作浓度（40μM）

配制方法：

（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。

（例如：假设合成引物每管2OD，若1OD的量为4.75 nmol （0.00475μmol），则一管引物的总摩尔数为2×4.75=9.5nmol，加水量为10×9.5＝95μl）

（3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。

2．探针工作浓度（20μM）

配制方法：

（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。

（3）将100μM的探针5倍稀释，此时浓度为20μM，可作为工作浓度。

以上配制仅仅是我们工作中常用的配制具体配制的关键是：注意各引物管实际所标

记的OD数，以及各型引物探针规定的工作浓度。此为09年下发的引物探针：

引物/探针名称 每管OD数 每管总摩尔数 (nmol) 稀释成100μM储存液加RNase free Water体积（μl） InfAForward InfAReverse InfAProbe SWInfAForward SWInfAReverse SWInfAProbe SWH1Forward SWH1Reverse SWH1Probe RnaseP-Forward RnaseP-Reverse RnaseP-Probe FluA-M-F30 FluA-M-R264 H1F1147 H1R1673 H1HA-F768 H1HA-R1094 SWH1F786 SWH1R920 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9.1 8.3 8.3 8.7 8.7 67 8.7 8.3 6.7 10.5 10 8.7 10.8 10.8 10.8 11.2 10.4 9.8 10.2 10.6 91 83 83 87 87 67 87 83 67 105 100 87 108 108 108 112 104 98 102 106

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