Western blot常见问题汇总-万类生物(3)

万类生物实验室多年Western blot经验分享

2. 物种差异：很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的长度并非完全一致，具体问题还要具体分析；

3. 蛋白本身的性质：① 分子量数值仅仅是一个氨基酸数值累加的相对值，与实际值本身存在差距；② 蛋白质存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻译后修饰可导致分子量增大，比如常见的CD家族蛋白糖基化修饰以后分子量都会增大许多；③ 蛋白质存在翻译后酶前体状态与激活剪切状态，可使分子量变小，比如MMP2蛋白，酶源与激活态大小分别是72kDa、63kDa；④ 蛋白质存在多个转录本由一个基因编码的形式，不同的转录本翻译得到的蛋白分子量不一样，比如JNK这个蛋白，本身分为JNK1，JNK2，JNK3三个亚型，三种亚型同源性较高，而且针对每个亚型还有不同分子量的转录本呈现；要想正确把握蛋白分量问题不仅仅要读说明书，还要关注这个蛋白的相关背景知识；

4. uniprot：这个数据库提供了关于蛋白预测分子量，亚型分类，转录本种类及最初发现这个蛋白的一些参考文献，Abcam、Santa cruz等著名抗体公司都有参考这个数据库进行抗体的设计，我们的抗体也是根据此数据库研发的，网址如下：http://www.77cn.com.cn/。 五、关于“白板”和“黑板”：

Western结果往往就处于“白板”与“黑板”之间的某个条件：

1. 白板：“白板”代表的意义是某些条件不足：① 首先要考虑蛋白提取问题，样本浓度是否过低，正常Western实验每孔需要20-40μg左右的蛋白；② 一抗的稀释比例，一般新手做WB都会按照说明书的比例去做，一般说明书都是1:500-2000之间的比例，如果是白板就需要加大抗体比例，如果按说明书的最低推荐比例还是“白板”，那应该不是稀释比例的问题了；③ 一抗孵育时间，常规的一抗孵育条件是4℃过夜，有时候抗体反应比较“迟钝”可能需要更强烈的孵育时间，比如延长孵育时间至2天，或者把摇床放入冰箱缓慢摇动孵育过夜，我们不建议37℃进行抗体孵育；④ 显色体系的选择，一般来说ECL化学发光要比DAB灵敏5-10倍以上，所以尽量使用ECL；ECL发光液也分很多种，普通型、灵敏型、超灵敏型，我们都尝试过，的确在信号上有非常明显的差异；当然延长曝光时间也是提高信号灵敏度最常规的方法；

2. 黑板：“黑板”顾名思义相对于“白板”，“黑板”代表的意义就是某些条件过量了；① 要考虑上样量；② 降低一抗稀释比例；③ 降低二抗稀释比例，二抗其实是非常成熟的产品，质量是有保证的，我们一直在用HRP二抗，1:5000，常温40min，基本不需要摸索二抗条件，总结起来还是一抗、二抗都要买放心厂家的；④ 缩短曝光时间。 六、关于封闭

封闭也是Western中比较关键的环节，一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中，常温下摇床缓慢摇晃，封闭1h；除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶，

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