万类生物实验室多年Western blot经验分享
Western Blot常见问题汇总—万类生物
Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，不同的是其采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，并经过底物显色检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
万类生物成立至今，做过的Western blot实验不下数万板，我们曾经也遇到过跟您一样的困难，最终也一一化解，先将我们在Western blot实验方面积累的一些经验与大家一同分享，希望与大家共同交流： 一、关于蛋白提取：
1. 裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：
除了这些裂解buffer以外，为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的；在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行10-20s的超声破碎处理；此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDS loading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。
2. 干扰蛋白：培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。
二、关于胶浓度及电泳条件的选择：
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