Western blot常见问题汇总-万类生物(2)

万类生物实验室多年Western blot经验分享

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：

三、关于转膜的条件与注意事项：

转膜也是一个事关成败的重要因素，但是并不是所有问题都要归咎于“转膜不完全”，如何判断转膜是否合格呢？很多人最先想到的是“丽春红”，在这里我们对此持保留意见，不是说丽春红染色不对或者不好，而是我们完全可以通过预染marker条带的情况间接地判断转膜情况，何必让膜经历一次不必要的染色呢！下面来说说转膜条件：

1. 转膜条件：对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。

2. 转膜操作：准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。

四、关于分子量实际与预测结果的差异：

可能导致预测与实际分子量不一样的因素：

1. 预染marker的误差：由于预染marker是由标准蛋白与有色染料偶联而成的，所以偶联后的蛋白由于表面结构的改变，导致在SDS-PAGE中分离的线性关系没有天然蛋白那么好；另外由于偶联的批次不同，每个条带针对每个批次呈现出的分子量会有些许的变化，所以在使用预染marker的时候，出现5-10%的分子量误差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非预染marker来标定；

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