猪圆环病毒2型的分离鉴定及其对BALBc小鼠的致病性研究(8)

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病毒液，同时设不接种病毒的健康Dulac细胞为空白对照。每传三代收集细胞上清，12000 rpm离心10 min取上清参考本章2.2的方法提取DNA，并用2.3的方法检测PCV2的感染增殖情况。

2.4.2 PCV2全基因组分段测序引物

参考genebank序列（登录号AF201897，全长1767 bp）设计下面4对引物（表1-2）

[4]

，引物均由上海生物工程有限公司合成，使用前用灭菌的超纯水溶解配成浓度为20

μmol/mL，-20℃保存备用。

表1-2 PCV2全基因组测序引物

Table.1-2 sequencing primers of the PCV2 whole genome

Primer名称 PCV2 P11 PCV2 P12 PCV2 P13 PCV2 P14 PCV2 P15 PCV2 P16 PCV2 P17 PCV2 P18 序列(5'to3') TAATCCTTCCGAAGAGGAGC CGATCACACAGTCTCAGTAG CAGAAGCGTGATTGGAAGACC ATGTAGACCACGTAGGCCTC AGAAGCTCTTTATCGGAGGA AAGCGAACCACAGTCAGAAC CTAGAATAACAGCACTGGAG GTTCGTCCTTCCTCATTACC 扩增片段长度(bp) 引物起止位置 629 116-745 630 532-1161 701 863-1564 621 1360-193 2.4.3 PCV2全基因组测序PCR扩增反应体系 在PCR管中依次加入下列试剂，建立50 μl的扩增反应体系：

10×Reaction buffer(Mg2+ Free) MgCl2(25 mmol/L) dNTPs (10 mmol/L)

上游引物P11 or P13 or P15 or P17 (均为20 μmol/L) 下游引物P12 or P14 or P16 or P18 (均为20 μmol/L) DNA模板 Taq DNA聚合酶 超纯水

5 μl 3 μl 1 μl 1 μl 1 μl 5 μl 1 μl 33 μl

PCV2全基因组PCR扩增的反应参数：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察PCR扩增结果。

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2.4.4 CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α[5]

取-20℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于固体LB培养皿，做好标记。37℃培养过夜。第二天从平板上挑取单个菌落，接种至含有5 mL 液体LB培养基的试管中，37℃，220 rpm振荡培养过夜。次日取菌液100 μl接种至含有10 mL 液体LB培养基的试管中，37℃，220 rpm振荡培养约2~3小时至OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上30 min。在无菌条件下把菌液倒入15 mL预冷的离心管中，4℃，2000r离心10分钟，弃上清，将离心管倒置于干滤纸上吸干残留的培养液。加6 mL 1%的CaCl2到离心管中，轻轻振荡混匀，冰浴30分钟。4℃，2000 rpm离心10分钟，弃上清。加10 mL预冷的0.1 M的CaCl2，重新悬浮菌体。每冻存管分装0.8 mL，4℃保存备用或滴加0.2 mL甘油再保存于-70℃低温冰箱中。

2.4.5 DNA片段的纯化回收及测序

PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切去有条带的胶，使用Agarose gel DNA extraction kit按产品说明书回收片段，最后用25 μl超纯水洗脱并测出DNA浓度，将回收的PCR产物连接pMD ? 19-T Vector。连接体系（10μl）：pMD ? 19-T Vector 1 μl，Insert DNA 4 μl，Solution I 5 μl。16℃连接4小时或4℃连接过夜。将连接产物与感受态细菌轻轻混合，冰浴30 min，42℃热休克90 s，立即冰浴2~3 min，补加37℃预热好的LB培养基0.8 mL， 37℃摇床上100 rpm培养45 min后，5000 rpm离心5 min，弃去800 μl培养基，用剩余的培养基重悬菌体并涂布Amp+培养皿，置于37℃培养箱中培养约14 h。次日挑取单个白色菌至含Amp的LB液体培养基中培养。

用碱裂解法[6]小量提取质粒：吸取1.0 mL培养物至1.5 mL指形管中，12000 rpm离心1 min，弃上清，加入4℃预冷的溶液I ，每管100 μl，用移液枪轻轻吹打混匀；加溶液II，现配现用，取室温保存的0.04 mol/L NaOH和2% SDS 等体积混匀，每管200 μl，轻轻上下颠倒混匀，冰浴5 min；再加4℃预冷的溶液III，每管150 μl，轻轻混匀，冰浴5 min，12000 rpm离心5 min，取400 μl上清至新指形管，加400 μl酚:氯仿（1:1），用力剧烈混匀，冰浴放置约5 min分层后 10000 rpm，离心2 min; 小心吸取300 μl上层水相至新的指形管中，加2倍体积的无水乙醇( -20℃预冷)，轻轻混匀，放置-20℃冰箱30 min沉淀核酸，12000 rpm离心10 min，弃上清，每管加800 μl 70% 乙醇，轻轻颠倒混匀数次，12000 rpm离心5 min，弃上清，瞬离，用移液枪吸去剩余液体，放置超净台自然挥发至无可见液体。加30 μl含RNase ( 20 pg/mL ) RTE ( pH 8.0 )溶解质粒DNA，37℃水浴作用30 min，立即使用或者-20℃保存备用。

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提取的质粒DNA参照本章2.3.1的方法检测PCV2。用1%琼脂糖凝胶进行PCR的电泳鉴定，将检测为阳性并且目的条带正确的质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

2.5序列分析

本文使用的DNAStars 5.0序列分析软件为美国DNASTAR公司产品(Madison，WI 153715，USA)，运用软件Megalign构建系统发生树，将本章2.4.5测得的9株PCV2毒株全基因组序列与GenBank中的已发表的PCV2序列进行同源性比较，构建系统发生树（表1-3）[7]。

表1-3 PCV2遗传发生树参考毒株

Table 1-3 Reference strains of PCV2 used in this study for the phylogenetic analysis Accession number AY641542 AY322000 AY691169 AY678532 AY291317 AY484410 AF109398 AF117753 AB072302 AY146991 AY180397 AY256459 AF201308 AY424401 AF201305 AF544024 AF118097

Strain name JH0401 Fd1 QZ0401 ZS0401 HB

NZ-Control-4 2-C 2-D

Japan-AB072302 Pingtung-1 Pingtung-5 Hungary- AY256459 SPA1 AUT1 GER1 KSY-2 IAF-4370

Contry and City China France China

Zhejiang，China Hubei，China Netherlands Canada Canada Japan Taiwan,China Taiwan,China Hungary Spain Australia Germany Korea Canada

Clade 1A 1A 1B 1B 1C 1C 2A 2A 2A 2B 2B 2C 2C 2D 2D 2E 2E

2.6病毒纯度的检测

将接种PCV2的Dulac细胞毒收毒：取本章2.4.1中PCR鉴定有条带的Dulac细胞连续传约10代，待细胞长满后换成维持液继续培养48 h后收毒，收毒时将细胞瓶放-70℃/室温反复冻融三次，12000 rpm 离心5 min收集上清，-70℃保存备用。

参考本章2.2.2和2.2.3的方法提取上清中的DNA和RNA反转录的cDNA，按照本章2.3的方法进行PCR扩增，取7 μl PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测鉴定.

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2.7间接免疫荧光试验（IFA）

用0.25%胰酶消化长势良好的健康Dulac细胞（无PCV1污染），分装至96孔板中，37℃培养24 h，弃去培养基，用PBS洗涤，每孔加100 μl 本章2.6中收集的上清，吸附1.5 h后，补加4% DMEM营养液继续培养，以PCV2 (121108毒株) 感染的Dulac细胞作为阳性对照、正常的Dulac细胞作为阴性对照。48 h后倾去细胞培养液，PBS洗涤三次，每次5 min，弃去PBS，自然晾干后用冷甲醇-20℃固定20 min，弃去固定液，自然晾干，立即使用或-20℃保存。将已固定的细胞板用PBS洗涤三次，每次5 min，自然干燥；加入1∶1000稀释的猪源PCV2阳性血清50 μl，37℃水浴作用1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，拍干；加入1:200稀释的羊抗猪荧光二抗，37℃水浴作用45 min，同样洗涤后拍干，荧光显微镜下观察[8]。

2.8 细胞冻存

检测为PCV2阳性且不含有其他外源病毒的Dulac细胞PBS洗涤后用0.25 %胰酶消化，加适量DMEM培养基悬浮细胞，移至10 mL离心管中1000 rpm离心5 min，加1 mL细胞冻存液（10% DMSO，10% FBS，DMEM培养基）用滴管轻轻吹打混匀重悬细胞，吸至冻存管，标明冻存细胞、日期等信息，放到细胞冻存盒后-70℃过夜，转移到液氮罐中长期保存。

3 结果与分析

3.1 针对PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV 六种病毒的电泳条带

以PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的DNA样品为模版，使用本论文使用的对应的引物，PCR扩增出与实验设计相符合的6条特异性条带，条带大小分别为702 bp、569 bp、500 bp、277 bp、377 bp、288 bp（见图1-1）。

M: 100 bp DNA marker 1: PCV1 PCR product 2: PCV2 PCR product 3: PPV PCR product 4: PRV PCR product 5: PRRSV PCR product 6: CSFV PCR product

图1-1 6种病毒的PCR扩增结果

Fig. 1-1 PCR amplification result of 6 kinds of viruses

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3.2 样品采集情况

2014-2015年间共采集病料 439份，其中从扬州某屠宰场采集已屠宰猪的样品共 205份，占总数的46.7%，从扬州大学动物医院采集病死猪病料共 234份，占总数的53.3% 。

3.3 采集的样品中6种病毒检测情况

从表1-4和表1-5可以看出，动物医院和屠宰场所采集的样品中均以PCV2阳性率最高，分别达到52.6% 和58.1% 。从每个月份的阳性率来看，PCV2感染并没有呈现明显的季节性；PRV阳性率为14.5%，居第二；PCV1和PPV阳性率比较相近，分别为11.5%和10.7%；PRRSV和CSFV检测阳性率均较低，分别为6.0%和5.1%，PPV基本全年都能检测到，但PRRSV和CSFV主要集中在下半年。

屠宰场采集的样品中PCV2阳性率为58.1%，PCV1阳性率也较高，达到15.1%；PPV和PRV阳性率分别为2.4%和0.7%；未检测到PRRSV和CSFV。屠宰场样品为随机采集，主要来源于江苏及附近省份，从检测结果来看PCV2感染较为严重。规模化屠宰场采集的样品除PCV1和PCV2外其他4中病毒检测阳性率都比较低甚至未检测到。

表1-4 2014年扬州大学动物医院所采集病料的6种常见病源的流行病学调查结果 Table 1-4 The detection results of clinical samples collected from animal hospital in 2014

各病毒的阳性数及阳性率

采样月份

PCV1

2014.2 2014.3 2014.4 2014.5 2014.6 2014.7 2014.8 2014.9 2014.10 2014.11 2014.12 合计

3(13.6) 2(10.5) 5(15.2) 1(9.1) 2(15.4) 2(8.0) 1(4.5) 3(11.1) 2(10.5) 3(15.8) 3(12.5) 27(11.5)

PCV2 10(45.5) 7(36.8) 22(66.7) 3(27.2) 5(38.5) 13(52.0) 12(54.5) 11(40.7) 2(10.5) 16(84.2) 22(91.7) 123(52.6)

PPV 2(9.1) 1(5.3) 5(15.1) 1(9.1) 0 2(8.0) 1(4.5) 6(22.2) 3(15.8) 0 4(16.7) 25(10.7)

PRV 0 4(21) 2(6.1) 0 0 0 3(13.6) 8(29.6) 3(15.8) 1(5.3) 13(54.2) 34(14.5)

PRRSV 1(4.5) 0 4(12.1) 0 2(15.4) 0 5(22.7) 0 0 0 2(8.4) 14(6.0)

CSFV 2(9.1) 0 0 0 0 3(12.0) 1(4.5) 0 2(10.5) 2(10.5) 2(8.4) 12(5.1)

22 19 33 11 13 25 22 27 19 19 24 234 样品数量

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