猪圆环病毒2型的分离鉴定及其对BALBc小鼠的致病性研究(3)

江苏部分地区猪圆环病毒2型的分离鉴定及其对BALB/c小鼠的致病性研究

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综 述

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、猪繁殖障碍、猪先天性振颤等疾病的主要病原之一，最先由Ellis等从患有PMWS的猪体内分离到，属圆环病毒科、圆环病毒属。PCV2主要感染5~12周龄断奶仔猪[1]，引起仔猪增重缓慢、免疫能力低下、迟缓、衰弱、呼吸困难、贫血淋巴结肿大，给养猪业造成巨大损失。因此，对PCV2的研究有重要意义。

1 病原特征 1. 1病毒的理化特性

猪圆环病毒（PCVs），是目前为止发现的最小的动物病毒，包括两种血清型，PCV1和PCV2，属于圆环病毒科圆环病毒属[2] 。PCV2是无囊膜的单股负链环状DNA病毒，其基因组有1766~1768个核苷酸，而PCV1的基因组相对较短，含有1759个核苷酸[3]。病毒粒子为二十面体对称结构，直径约为17nm。Tischer[4]发现PCV1在Cscl中的悬浮密度为1.37 g/cm3，Allan[5]发现其悬浮密度为1.33-1.34 g/cm3，其沉降系数为57 S。PCV不能凝集红细胞[6]，并且在pH为3的酸性环境中不会被灭活，对氯仿也不敏感，在56℃或70℃处理一段时间也不被灭活[5]，一般消毒剂很难将其杀灭。

1.2 PCV2的分子学特性

PCV有PCV1和PCV2两种血清型，但是发现PCV1是非致病性的，而PCV2致病性较强，是引起断奶仔猪多系统衰竭征（PMWS）的必要的感染因子[1]。虽然PCV1和PCV 2在致病性上有很大的差异，但是这两个病毒在基因水平上非常相似，它们之间有近80%的核苷酸同源，同一血清型的核苷酸同源性大于90%[3, 7, 8]，但它们是否来源于同一祖先的可能性还未进行探究。1974 年Tischer等人在猪肾细胞系PK-15（ATCC CCL-13）发现一种新的污染物，其后被命名为猪圆环病毒(PCV)，而后发现该病毒对细胞没有致病性[5,

9]

，该病毒即PCV1。而PCV2是在20年之后从患有断奶仔猪多系统衰竭征（PMWS）的

猪体内分离得到的[10]。PCV2具有类似于RNA病毒的高突变率，其毒力主要取决于具体的分离株，而与其基因型无关[11]。

猪圆环病毒1型（PCV1）的复制是通过一个产生双链的复制中间体（RF）进行滚环复制[12]。由复制中间体的另外一条链编码的PCV1的7个开放式阅读框(ORFs)，其表达的蛋白分子量均大于5 kD[13]。已有研究表明PCV1的大多数的结构蛋白是由ORF2编码。

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猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组分为三个主要的开放式阅读框（ORFs），ORF1编码的复制相关蛋白Rep主要参与病毒的复制，此段序列高度保守[14]。ORF2编码核衣壳蛋白Cap[15] ，在不同的PCV2的分离株中，ORF2有91-100%的核苷酸同源性，90%-100%的氨基酸序列是一致的[16, 17]。ORF3编码的蛋白不是PCV2复制的必要蛋白，但是其编码的蛋白可以通过激活capase-8和capase-3酶诱导细胞凋亡[18]。ORF2是PCV2菌株的基因分型的决定因子，其编码核衣壳蛋白的基因比其他的ORFs的可变性更强[19]。PCV1和PCV2的基因的组织结构比较相似，均包含11个潜在的开放式阅读框（ORFs），其中ORF1、ORF5、ORF7以及ORF10位于病毒的有意义链上并且是按顺时针方向进行转录，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11位于互补链上的并且是逆时针方向进行转录[7]。ORF1和ORF2，位于基因组相反的方向，是PCV1和PCV2的两个重要的开放式阅读框（ORFs）。ORF1编码的Rep和Rep’蛋白，是病毒复制必需的蛋白[20]，而ORF2编码一个27.8 kDa的免疫性的Cap蛋白，它也是PCV2唯一的结构蛋白[15]。最近有研究表明，在非致病性的PCV1主链上嵌入PCV2编码Cap蛋白的基因组成的PCV1-2的DNA克隆，感染猪后发现与PCV2野生株相比毒力有所降低，但是在感染猪动物实验中发现，PCV2的野生株与ORF3缺失的PCV2毒株之间的致病性并没有显著性的差异[21]。这些研究显示，ORF2和ORF3编码的病毒蛋白都不是唯一决定PCV2致病性的蛋白，目前并不能确定PCV2编码的所有的蛋白中的哪个蛋白控制其致病性。

PCV2的ORF4（180个核苷酸，位于386-565之间）位于ORF3的内部并且与其方向一致，最近研究表明，PCV2 ORF4表达的蛋白对PCV2 的复制不是必需的，但是在PCV2的感染中有重大的作用，它可以抑制Caspase酶的活性并且调节CD4+和CD8+T淋巴细胞的活性[22]。PCV2的ORF4编码的可能是含有55个氨基酸的分子量为6.5 kDa的肽链，而在PCV1上与其一致的区域能够编码分子量为13.3 kDa含有115个氨基酸的肽链

[7]

。

1.3 PCV2的分型

欧盟在2008年为猪圆环病毒制订了统一的命名法，PCV2的分型是根据ORF2序列上基因的距离分为不同的基因型，分别命名为PCV2a，PCV2b和PCV2c[23]。另一方面，Wang和Guo等[24]根据其复杂的基因组将中国的PCV2的菌株分为PCV2a，PCV2b，PCV2d和PCV2e，以及其他的未识别的基因型，并且发现最近几年在中国PCV2b占主导地位。

系统进化分析表明PCV2的两种主要的分型即PCV2a和PCV2b。每种分型又有其分枝，PCV2b又被分为1A到1C，而PCV2a被分为2A到2E[19]。第三种分型PCV2c，只在

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丹麦的猪体内发现过[25]。有许多研究表明，PCV2b比PCV2a毒性更强，更具有优势[26]。然而，PCV2a和PCV2b的猪人工感染实验表明，这两种基因型在毒力上并无差别[27]。

1.4 PCV的细胞培养特性

猪肾细胞系PK-15已广泛应用于体外的PCV2的培养[28, 29]。PCV2能在单层PK-15细胞上增殖且不发生细胞病变，但对感染PCV2的PK-15细胞进行免疫荧光实验的结果显示，只有20%的细胞对PCV2敏感[30]。Tischer等发现，加入300 mmol/L的D-氨基葡萄糖或者延长培养时间都能提高病毒滴度[4]。为了区分PCV2在不同的亚克隆的PK-15的细胞系上的复制，利用间接免疫荧光（IFA）来检测PCV2感染后的细胞在不同的时间段的Cap蛋白以及Rep蛋白表达量，发现PCV2感染的最初阶段能够结合所有的PK-15细胞

[31]

。但最近研究表明，只有少量的细胞能够被感染并产生低滴度的PCV2[29, 32]，PK-15细

胞对PCV2的敏感性也不一样。Zhu Yu[31]等和Chen[33]等发现，一种PK-15细胞的亚型对PCV2更为敏感，可用来繁殖病毒和生产疫苗，Haines 等提出Dulac细胞是不含PCV病毒的PK-15细胞的亚系，并且可以比PK-15细胞更好的用来分离PCV2病毒。Wellenberg[34]等用PK-15细胞分离到的PCV2分离株分别感染PK-15和Dulac细胞，利用间接免疫荧光（IFA）和免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA）在这两个细胞中都检测到了PCV2，接种的PK-15细胞和Dulac细胞均没有产生细胞病变。但有实验表明，PCV2能通过激活起始因子酶Caspase-8和效应因子酶Caspase-3来诱导被感染的PK-15细胞的凋亡[18]。通过RT-PCR发现， PCV2在感染的PK-15细胞中可以表达ORF3的蛋白，在细胞核中ORF3表达的蛋白占优势，而在细胞质中的表达略为下降。PCV2感染PK-15细胞的后期PCV2在细胞中的大量复制会导致细胞病变，比如被感染细胞在细胞瓶的皱缩、脱落以及细胞溶解、死亡。但PCV2感染PK-15细胞如何导致其死亡的机制还未有研究。也有实验表明PCV1能够在Vero细胞上进行复制[10]。

2 PCV的流行病学

圆环病毒家族能够感染猪、鹅、金丝雀、鸽子和鹦鹉[30, 35]。猪对圆环病毒有较强的易感性，能够感染各年龄段的猪，但仔猪感染后发病严重。被PCV感染的猪通过呼吸道分泌物、口腔分泌物、粪便等废物中排出毒素，经消化道、呼吸道感染其他的猪。猪圆环病毒（PCV）广泛存在于许多国家猪群中，其血清阳性率达53%-92%。研究发现，PCV的感染可能多发生于育肥期的猪，因为在此期间，猪之间的接触较为紧密。另一个研究表明[36]，在德国，PCV阴性猪的比例随猪龄的增加而减少，比例从断奶仔猪的65%到年老的猪的5.6%。通过间接免疫荧光（IFA）和酶联免疫吸附实验（ELISA）发现在人

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类、小鼠以及牛血清中存在PCV抗体。PCV可以感染牛和猪，但并不能感染绵羊和人类以及体外培养的单核细胞[37]。

由于PCV1感染后不会引起严重的疾病[9]，而经PCV1感染的动物也没有表现出任何临床症状，所以从一开始并没有引起人们对动物健康的重视，而当在北美和欧洲出现了一种新的猪的疾病的时候，猪圆环病毒（PCV）才引起了人们的重视和关注[8]。1991年加拿大首次发现了猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)[2]，此后，PCV2的流行以及断奶仔猪多系统衰竭征（PMWS）已经在全世界蔓延[38-40]。1998年泰国报道亚洲首例断奶仔猪多系统衰竭征，发生于7至9周龄的猪，然而追溯到之前的研究表明在1993年已有PCV2的感染

[41]

。已有证据表明PCV2可以通过垂直传播，Bolin[42]等发现人工感染的猪或小鼠和健康

的猪或小鼠同圈饲养一段时间，健康的猪或小鼠同样会被感染，证明PCV2可以在猪群和鼠群中水平传播。根据实验[10]，用PCV2的细胞培养物感染1日龄的无菌猪，接种31天后在粪便、唾液、鼻拭子中均能检测出病毒核酸。PMWS作为一种为新型的传染性疾病，在养猪业中广泛流行，对养猪业有极大的威胁。

PMWS发生于断奶和育肥阶段的猪，PCV2被认为是PMWS最主要的致病因子[43]。严格意义上说来，我们对PCV2的致病性研究尚未全面，因为PCV2感染猪并不一定导致PMWS，而且血清学实验表明在健康猪群中也发现了PCV2的感染[44]。有研究表明，PCV2可以与其他的传统的致病因子混合感染，比如猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒以及牛病毒性腹泻病毒等[45-49]。最近研究显示，在美国中西部有高于60%的PMWS都是与猪蓝耳（PRRSV）混合感染导致的[10]，。

我国由郎洪武等在2001年首次报道了从猪群中分离到PCV2，王忠田等（2002）在对北京、天津、广东、深圳、山东、山西等地12个规模化猪场进行圆环病毒流行病学调查时发现，12个猪场都有PMWS的发生。翟少伦[50]等在2008-2009年对118株PCV2的阳性菌株进行分子流行病学调查，结果表明，患病猪中的32.2% (38/118)的PCV2是混合感染，而在没有明显症状的猪中的混合感染为0(0/41)。对这38株混合感染的菌株进行分型，结果分别是PCV2a-PCV2b(12/38)，PCV2a-PCV2d(15/38)，PCV2e-PCV2d(11/38)。有研究表明[50]，在1997-2003年之间，在许多国家的猪群中，无论这些猪是否患有断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS），PCV2a均占优势，但其他的数据表明，自2004年以来，PCV2b型的毒株在欧美和亚洲流行的患有PMWS的猪群中更普遍。

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3 与猪圆环病毒相关的疾病

猪圆环病毒特别是猪圆环Ⅱ型病毒（PCV2）在养猪业中引起了巨大的危害。PCV2与欧洲的猪圆环病毒病（PCVD）[51]以及北美的猪圆环病毒相关疾病[52]（PCVAD）关系密切。除了断奶仔猪多系统衰竭征（PWMS），PCVD/PCVAD外还包含生殖系统障碍[42]，猪皮炎肾病综合征（PDNS）[53]，神经系统损害即新生仔猪先天性震颤（CT）[54]，猪呼吸道疾病综合征（PRDC）[55]，肠炎[56]，以及增生坏死性肺炎[57]（PNP）。最近还发现一种新的与PCV2相关的疾病叫做肺急性水肿（APE）[58]。

3.1 断奶仔猪多系统衰竭征（PWMS）

常见的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）主要发生于5~16周龄的猪，最常见于6~8周龄的猪，极少感染乳猪。一般于断奶后2~3天或1周开始发病，急性发病猪群中，病死率可达10%，猪后期发育明显受阻。但常常由于并发或继发细菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可达25%以上。PMWS的症状包括进行性消瘦、昏睡，贫血、暗黑色的腹泻、淋巴结肿大和黄疸[52]。早期症状可见体重减少、皮肤苍白、毛发粗糙，但这些症状往往会被忽视。随后会导致呼吸困难、急促、贫血、腹泻以及黄疸。尸检后发现：肺衰竭或萎缩，外观成斑点状，同时可见腹股沟浅淋巴结、下颌下淋巴结、肠系膜淋巴结以及纵膈淋巴结显著肿大[59]，在肺、肝、肾、心以及肠道中有肉芽肿病变。慢性感染时会发现肾有白色斑点[59]。组织学病理损伤可见典型的巨噬细胞浸润和淋巴细胞缺失，胞浆内有包涵体[60]。也有可能造成间质性肺炎以及不同程度的肝炎和间质性肾炎。

3.2 繁殖障碍

这种症状首次于1999年在加拿大被报道。主要感染初产母猪，临床症状包括流产率增加，产死胎、木乃伊胎，断奶前仔猪死亡率增加[61]。死胎及新生胎儿的组织学病理学变化表现有非化脓性坏死或纤维素性心肌炎。感染发生的时间决定了疾病感染的过程。在妊娠前期接种的PCV2病毒的胎儿比在怀孕后期感染的胎儿的病毒复制能力更强些，表明PCV2感染不同阶段的妊娠的猪会造成其病毒复制能力有差异[62-63]。但有数据表明大多数的种猪群对此类疾病具有免疫力[52]。

3.3 猪皮炎肾病综合征（PDNS）

猪皮炎与肾病综合征（PDNS）是主要侵害猪的皮肤和肾脏的一种传染病，该病首次报道于1993年的英国[64]，在2000年才证实其与PCV2相关[53]。此病发生3天后会导致死亡，主要发生于育肥期的猪，也能够感染5周龄的猪。被感染的猪出现急性发作的高烧，昏睡，后腿上出现圆形或不规则的紫色皮肤损伤等临床症状。其病理变化有肾脏肿大，

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