实验室啤酒发酵实验讲义[1](3)

在11℃液温用糖表读得啤酒主发酵液为4.2糖度，问20℃的糖度为多BX？多少 plato？查表：观测糖锤度温度校正表，11℃时的4.2糖度应减去0.34得3.86，即20℃时为3.86BX，亦即3.86plato。

巴林比重计：含义与勃力克斯比重计相同，但规定在17.5℃使用，而不是在20℃使用。

糖度表本身作为产品允许出厂误差为0.2BX，放在啤酒发酵液中指示时，由于CO2

上升的冲力使表上升，而读数偏高，故刚从发酵容器取出的样品须过半分钟待CO2逸走后再读数，糖度表一直放在发酵液中作长期观测时，不读数时应设法使其全部没入发酵液中，否则浮在液面的泡盖物质会干结在表上，造成明显的读数偏差。 三、实验器材：糖锤度计

四、实验步骤：取100mL麦汁或除气啤酒，放于100mL量筒中，放入糖锤度计，待稳定后，从糖锤度计与麦汁液面的交界处读出糖度，同时测定麦汁温度，根据校准值，计算20℃时的麦汁糖度。若糖度较低，糖度计不能浮起来，可多加一些麦汁，直至糖度计浮在液体中。

表3-2-6 糖锤度与温度校正表（部分）

温度 1 Bx 2 Bx 3 Bx 4 Bx 5 Bx 6 Bx 7 Bx 8 Bx 9 Bx 10 Bx 11 Bx 12 Bx 15℃ 0.20 0.20 0.2 0.21 0.22 0.22 0.23 0.23 0.24 0.24 0.24 0.25 16℃ 0.17 0.17 0.18 0.18 0.18 0.18 0.19 0.19 0.20 0.20 0.20 0.21 17℃ 0.13 0.13 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.15 0.15 0.15 0.15 0.16 18℃ 0.09 0.09 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 19℃ 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

- - - - - - - - - - - -

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

0 +

20℃ 0

+

21℃ 0.04 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 22℃ 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 23℃ 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 24℃ 0.21 0.21 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.23 0.23 0.23 0.23 0.23 25℃ 0.27 0.27 0.28 0.28 0.28 0.28 0.29 0.29 0.30 0.30 0.30 0.30 26℃ 0.33 0.33 0.34 0.34 0.34 0.34 0.35 0.35 0.36 0.36 0.36 0.36 27℃ 0.40 0.40 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 28℃ 0.46 0.46 0.47 0.47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.50 29℃ 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 30℃ 0.61 0.61 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.63 0.63 0.63 0.64 0.64 31℃ 0.69 0.69 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.71 0.71 0.71 0.72 0.72 32℃ 0.76 0.77 0.77 0.78 0.78 0.78 0.78 0.79 0.79 0.79 0.80 0.80

五、注意事项：糖锤度计易碎，使用时要格外小心 六、思考题：试比较勃力克斯与plato的异同。

实验八 啤酒主发酵

一、实验目的：学习啤酒主发酵的过程，掌握酵母发酵规律。

二、实验原理：啤酒主发酵是静止培养的典型代表。是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，在一定温度下培养的过程。由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。显然，同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体，因而前者降糖较快（所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时，所用液体培养基至少要1.5米深，才接近生产实际）。定期摇动容器，既能增加溶氧，也能改善液体各成份的流动，最终加快菌体的生长过程。这种有酒精产生的静止培养比较容易进行，因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力，容许一定程度的粗放操作。由于培养基中糖的消耗，CO2与酒精的产生，比重不断下降，可用糖度表监视。若需分析其他指标，应从取样口取样测定。

三、实验器材：带冷却装置的发酵罐（50L，100L），若无发酵装置，可将玻璃缸放于生化培养箱中进行微型静止发酵。 四、实验步骤：

将糖化后冷却至10℃左右的麦芽汁送入发酵罐，接入酵母菌种（实验四，共约5升），然后充氧，以利酵母菌生长，同时使酵母在麦汁中分散均匀（充氧，即通入无菌空气，也可在麦汁冷却后进行，一般温度越低，氧在麦汁中的溶解度越大），待麦汁中的溶解氧饱和后，让酵母进入繁殖期，约20小时后，溶解氧被消耗，逐渐进入主发酵。

由于发酵罐密闭，很难看清发酵的整个过程，建议一个组在1000 mL玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验。具体方法如下：

1、 洗标本缸，缸口用8层纱布包扎后，进行高压灭菌；

2、 将协定法糖化得到的麦汁，加水至600 mL，再加葡萄糖使糖度达到10 Bx，灭菌，冷却后摇动充氧，沉淀，将上清液以无菌操作方式到入已灭菌的标本缸中。 3、 将50mL酵母菌种接入，在10℃生化培养箱中发酵，每天观察发酵情况。

4、 主发酵： 10℃，7天→至4.0 plato时结束（嫩啤酒）。一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期，起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别。

主发酵测定项目 接种后取样作第一次测定，以后每过12或24h测1次直至结束。全部数据叠画在1张方格纸上，纵坐标为7个指标，横坐标为时间。共测定下列几个项目：

a、糖度（用糖度表测，并换算成plato）； b、细胞浓度、出芽率、染色率； c、酸度

d、α-氨基氮 e、还原糖 f、酒精度 g、pH h、色度 I、浸出物浓度 J、双乙酰含量

6、作业要求

⑴. 画出发酵周期中上述10个指标的曲线图，并解释它们的变化。 ⑵. 记下操作体会与注意点 附：发酵液的取样方法

若在发酵罐中发酵，可从取样开关处直接取样（先弃去少量发酵液）。

若无取样开关，可用一灭过菌的乳胶管，深入发酵池面下20cm处，用虹吸法使发酵液流出，，弃去少量先流出的发酵液，然后用一清洁干燥的三角瓶接取发酵液作样品。 五、注意事项：除少数特殊的测定项目外，应将发酵液在两干净的大烧杯中来回倾到50次以上，以除去CO2，再经过滤后，滤液用于分析。分析工作应尽快完成。

实验九 总还原糖含量的测定（斐林试剂法）

一、实验目的：学习用斐林试剂测还原糖的方法，

二、实验原理：斐林试剂由甲、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙溶液分开贮存，测定时才等体积混合，混合后，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀： 2Na0H十CuS04 ——→Cu（OH）2↓十Na2SO4

氢氧化铜因能与酒石酸钾钠反应形成络合物而使沉淀溶解。酒石酸钾钠铜络合物中的二价铜是一个氧化剂，在氧化醛糖和酮糖（合称总还原糖）的同时，自身被还原成一价的红色氧化亚铜沉淀：反应终点用美蓝（亚甲基蓝）来指示。由于美蓝的氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原糖还原后，过量一滴还原糖立即使美蓝还原成无色的美白。 三、实验器材与试剂： 电炉，滴定管等 (1)斐林溶液

甲液：称取3.4939g结晶硫酸铜(CuS04·5H20)，溶于50mL水中，如有不溶物须过滤。 乙液：称取13.7g酒石酸钾钠，5g NaOH，溶于50mL水中，若有沉淀过滤即可。 (2)0.2％标准葡萄糖液： 精确称取于105℃烘至恒重的分析纯葡萄糖0.5000g，用水溶解后，加2.5mL浓盐酸，定容成至250mL。

(3) 1％美蓝指示剂： 0.5g美蓝溶于50mL蒸馏水中。 四、实验步骤 1.斐林溶液的标定

由于试剂的纯度不同，配制时称量、定容等有误差，各人所配的斐林试剂氧化能力会有差异，因此有必要对斐林溶液进行校准。配制准确时，斐林甲、乙液各5mL可氧化25mL 0.2％标准葡萄糖溶液。

①预滴定：准确吸取斐林甲、乙液各5mL，放入250mL锥形瓶中，加水约20mL，并从滴定管加入约24mL 0.2％标准葡萄糖溶液（如果斐林甲、乙液配制非常精确，从理论上说，应消耗25mL 0.2％标准葡萄糖溶液，故先加24mL），将锥形瓶置电炉上加热煮沸，维持沸腾2分钟，加入1％美蓝指示剂2滴，在沸腾状态下，以每两秒1滴的速度滴入0.2％标准葡萄糖溶液，至溶液刚由蓝色变为鲜红色为止。后滴定操作应在1分钟内完成，整个煮沸时间应控制在3分钟之内。记下总耗糖量V。

②正式滴定：与预滴定基本相同，只是用（V-1）mL标准葡萄糖代替24mL葡萄糖液，最后在1分钟内滴定完成。 2.试样的滴定

①稀释：将样品除气后，进行适当稀释，以期用15~50mL（最好20~30mL）稀释液使滴定完成。一般麦汁稀释50倍左右，啤酒主酵液稀释20倍左右。

②滴定：基本同上，也分预滴定和正式滴定。只不过用样品稀释液代替标准葡萄糖液，由于预滴定时不知道需要多少毫升稀释液，因此误差较大。正式滴定时先加入比预滴定少1mL的稀释液。正式滴定至少进行2次。

计算总还原糖量，以100 mL样品中含有的葡萄糖克数来表示 五、注意事项：

(1) 指示剂美蓝本身具有弱氧化性，要消耗还原糖．所以每次用量应保持一致。 (2) 次甲基蓝被还原为无色后，易被空气氧化又显蓝色，所以滴定过程应保持沸腾状态，使瓶内不断冒出水蒸汽，以防空气进入。

(3) 反应过程中不能摇动锥形瓶，沸腾已可使溶液混匀。

(4) 测定时须严格控制反应液体积，以保持一致的酸碱度。因此要控制电炉火力及滴定速度。

六、思考题：为什么要进行预滴定？

实验十 α–氨基氮含量的测定

一、实验目的：学习α–氨基氮含量的测定方法，控制麦汁或啤酒质量。

二、实验原理：α–氨基氮为α–氨基酸分子上的氨基氮。水合茚三酮是一种氧化剂，可使氨基酸脱羧氧化，而本身被还原成还原型水合茚三酮。还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应，生成蓝紫色缩合物，颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比，可在570nm下比色测定。

三、实验器材与试剂：分光光度计，电炉等

(1)显色剂 称取10g Na2HPO4·12H2O ，6g KH2PO4 ，0.5g水合茚三酮，0.3g果糖，用

水溶解并定容至100mL（pH 6.6~6.8），棕色瓶低温保存，可用两周。 (2)碘酸钾稀释液 溶0.2g碘酸钾于60mL水中，加40mL 95％乙醇。

(3)标准甘氨酸贮备溶液 准确称取0.1072g甘氨酸，用水溶解并定容至100 mL，0℃保存。用时100倍稀释。 四、实验步骤

(1)样品稀释 适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL（麦汁一般稀释100倍，啤酒50倍，啤酒应先除气）。

(2)测定 取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液，另3支各吸入2mL试样稀释液，剩下3支吸入2mL蒸馏水。然后各加显色剂1 mL，盖玻塞，摇匀，在沸水浴中加热l 6分钟。取出，在20℃冷水中冷却20分钟，分别加5mL碘酸钾稀释液，摇匀。在30分钟内，以水样管为空白，在570nm波长下测各管的光密度。 计算：

α–氨基氮含量（μg/mL）=（样品管平均O.D./标准管平均O.D.）×2×稀释倍数 说明：式中

(样品管平均O.D./标准管平均O.D.）：表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比；

2：标准管的α–氨基氮浓度（μg/mL），即（0.1072×14/75）×100；

五、注意事项：

(1)必须严防任何外界痕量氨基酸的引入，所用比色管必须仔细洗涤，洗净后的手只能接触管壁外部，移液管不可用嘴吸。

(2)测定时加入果糖作为还原性发色剂，碘酸钾稀释液的作用是使茚三酮保持氧化态，以阻止进一步发生不希望的生色反应。

(3)深色麦汁或深色啤酒应对吸光度作校正：取2mL样品稀释液，加1mL蒸馏水和5mL碘酸钾稀释液在570n m波长下以空白做对照测吸光度，将此值从测定样品吸光度中减去。 一、 思考题：啤酒色泽是否会对结果产生影响？

附：分光光度计的使用：现以SP-2000UV紫外可见分光光度计为例介绍使用方法。

a) 接通电源，预热20分钟，使仪器进入热稳定状态，仪器开始自检；

b) 自检结束后，仪器自动停留在546nm处，并自动调100%T和0%T，当仪器显示“546”

“100%T”，即进入测试状态；

c) 按方式键（MODE），将测试方式设定为吸光度方式，仪器显示“XXXnm，X.XXXAbs” d) 按波长设置键至所需要波长，如570nm；

e) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色杯中，插入比色槽中，盖上样品室盖； f) 将参比溶液推入光路中，按“100%T”键调整 “0Abs”； g) 将被测溶液推入光路中，读取显示器上的吸光度值； h) 搞好清洁卫生工作。 注意：比色杯贵重，应格外小心。

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