实验室啤酒发酵实验讲义[1]

实验室啤酒发酵讲义

一、

实验目的：熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。 二、

实验原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒）。

三、实验器材：

⑴. 100升发酵罐。 ⑵. 0~10 BX糖度表。 (3).10℃-30℃可调生化培养箱。 培养基：

⑴. 麦芽汁发酵培养基10Plato, 50升，糖化制取。 ⑵. 麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加2％琼脂，自然pH。 ⑶. 麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用。 菌种：啤酒生产用酵母菌株。 四、实验步骤：

（1）麦汁制备

（2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定 （3）菌种扩大培养

（4）啤酒主发酵：麦汁50升，10BX ，11℃→接种量1.5×10个细胞/mL →主发酵，11℃，5~7天→至4.0BX时结束（嫩啤酒）。在主发酵过程中，每天测定下列项目：糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨基氮、还原糖、酒精度 、pH、双乙酰。然后以时间为横坐标，这些指标为纵坐标，叠画于方格纸上。 （5）后发酵 五、作业要求

（1）. 画出发酵周期中上述上述指标的曲线图，并解释它们的变化。 （2）. 记下操作体会与注意点。

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实验一 协定法糖化试验

一、实验目的：协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（EBC）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。

二、实验原理：利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸（具体参见理论部分第二节）。 三、实验器材和试剂：

1 实验室糖化器：由水浴和500~600 mL的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器（此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。水浴上有4~8个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内都带有搅拌器，转速为80~100转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯壁，它离杯底距离只有1~2 mm。

2 白色滴板或瓷板，玻棒或温度计。 3 滤纸，漏斗，电炉。

4 碘溶液，0.02N： 2.5克碘和5克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升。 四、实验步骤

1. 协定法糖化麦汁的制备

（1）取50g麦芽，用植物粉碎机将其粉碎。

（2）在已知重量的糖化杯（500~600 mL烧杯或专用金属杯）中，放入50g麦芽粉，加200mL 46~47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟。

（3）使醪液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70℃。此时于杯内加入100 mL 70℃的水。

（4）70℃保温1小时后，在10~15分钟内急速冷却到室温。

（5）冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g。

（6）用玻棒搅动糖化醪 ，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。

（7）收集约100mL滤液后，将滤液返回重滤。过30分钟后，为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项试验前，需将滤液搅匀。 2. 糖化时间的测定

⑴ 在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70℃时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计

取麦芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，观察颜色变化。 ⑵ 每隔5分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色（不变色）为止，记录此时间。

由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。报告以每5分钟计算：

如 <10分钟 10~15分钟 15~20分钟等 正常范围值

浅色麦芽：15分钟内 深色麦芽：35分钟内

3. 过滤速度的测定

以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算，以快、正常和慢等来表示，1小时内完成过滤的规定为“正常”，过滤时间超过1小时的报告为

“慢”。 4. 气味的检查

糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味，应报以“正常”；若样品缺乏此味，则以“不正常”表示，其它异味亦应注明。 5. 透明度的检查

麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。 6. 蛋白质凝固情况检查

强烈煮沸麦芽汁5分钟，观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀，记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状，但麦汁仍透明清亮，则记录为“细小”；若虽有沉淀形成，但麦芽汁不清，可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固，则记录为“无”。 五、注意事项：

粉碎最好用EBC粉碎机，若用1号筛粉碎，细粉约占90%，用2号筛粉碎细粉约占25%。对溶解度好的麦芽，建议用2号筛。因为细粉太多影响过滤速度。

一般要求粗粒与细粒(包括细粉)的比例达1：2.5以上。麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层，因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细，不但会造成麦汁过滤困难，而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加，会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗，难以形成致密的过滤层，会影响麦汁浊度和得率。麦芽胚乳是浸出物的主要部分，应粉碎得细些。

为了使麦皮破而不碎，最好稍加回潮后进行粉碎。 六、思考题：糖化过程中麦芽中各种酶的作用。

实验二 啤酒酵母纯种分离

一、 实验目的：学习酵母菌种的纯种分离技术

二、实验原理：关于纯种分离，在基础微生物学实验中已学过稀释分离法和划线分离法，这里不再重复。这两种方法虽然简单，但并不能保证分离所得种的纯度。而单细胞分离法因可用显微镜直接检查，其纯度能得到充分保证。

林德奈单细胞分离法，即小滴培养法，是将酵母菌液充分稀释至每一小滴差不多含一个酵母细胞，然后在显微镜下确证只含一个细胞的小滴，经适当培养后，扩大保存。

盖玻片上小滴点样示意图 凹载片上湿室小滴培养适宜图

三、实验器材与试剂：显微镜，凹载玻片，计数板，盖玻片等。 四、实验步骤：

1. 取2块盖玻片，用分析天平称重（精确至0.1mg）后，在一块盖玻片（最好用血球计数

板的盖玻片）上用毛细滴管滴上9滴酵母培养基，合上另一玻片，再称重，计算每滴培养基的体积。

2. 用计数板计数酵母菌，用培养基对其进行高倍稀释，稀释至每滴培养基中大致含一个酵

母菌。

3. 在已灭菌的盖玻片上滴上酵母稀释液（每张玻片可滴9滴），放于已灭菌的凹载玻片上，

显微镜下观察，找到只含一个酵母菌的小滴，做上记号。

4. 30℃培养一定时间后（应放于湿室中），用无菌滤纸片吸走标记的酵母菌，进行扩大培

养和菌种保藏。

五、注意事项：因小滴易干，操作时动作要快，培养时要用湿室。

六、思考题：称重时为什么要用两块盖玻片？是否可以用微量移液器（如1微升）来代替称重？

实验三 啤酒酵母的计数

一、实验目的：学习用血球计数板计数酵母数量的方法，

二、 实验原理：啤酒发酵时，必须接入一定数量的酵母细胞；在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。酵母菌的计数常用血球计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板，被四条凹槽分隔成三个部分，中间部分又被一横槽隔成上下两半，每一半上各刻有一个方格网，方格网的边长为3mm,分为9个正方形大格，每一大格为1mm,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25（或16）个中格，每个中格又被单线分成16（或25）个小格，因此一个大格中共有25×16=400个小格。这样的一个大格就是一个计数室。由于计数室比板表面要低0.1mm,因此盖上盖玻片后，整个计数室的容积就是0.1 mm,相当于0.0001mL。

计数时，先让计数室中充满待检溶液，然后计数400个小格中的细胞总数，就可换算出1mL发酵液中的总菌数。

三、实验器材：显微镜，血球计数板，盖玻片等。 四、实验步骤：

1. 取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片；

2. 取酵母菌液（发酵液）一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，注意计数室内不能留有气泡。

3. 静置5分钟，让酵母细胞稳定附着于计数室内；

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4. 将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间（寻找时可通过缩小光圈，降低聚光镜，开低电源电压等方式减少进光量，使视野稍偏暗）； 5. 找到计数室位置（中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格（16或25格）及由单线包围的小方格（共400格）；

6. 计数大格内的酵母细胞总数，必要时可在高倍镜下观察。 若酵母细胞过多，可采取 （1）：稀释后再计数；

（2）：有代表性地选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格，计数其内的菌数，求得每个中格的平均值，然后乘以中方格数（25或16），即得每个大格内的细胞总数； （3）：在上述5个中方格中选择处于顶角的4个小方格，计数，计算20个小方格中的总菌数，再乘以20，即得大格内的细胞总数。 7. 计算：

酵母细胞数/mL=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数 8. 血球计数板的清洗：

将血球计数板立即用流水冲洗干净，若菌液变干，酵母细胞被固定在计数板上，则很难用流水冲洗干净，必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗，再用流水冲洗干净，凉干 五、注意事项：

1. 血球计数板的计数室内刻度非常精细，清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。 2. 加样前，应先放好盖玻片，让菌液自然吸入。如果先加菌液，则由于盖玻片较轻，可能会浮在菌液上，这样，计数室内的容积就不再使0.0001mL了。因此，为了使结果更加准确，最好不要用普通的盖玻片来替代。

3. 计数时，为避免重复或遗漏，对压在方格线上的细胞，应遵循数上不数下，数左不数右的原则（即凡压在上部或左面线上的细胞，都应计数入内，凡压在下部或右面线上的菌体，都应忽略不计）。对出芽细胞，如果子细胞大于母细胞的一半，则应算作两个细胞。 六、思考题：

计数时，发现计数板不干净，怎样快速地清洗计数板？

实验三 啤酒酵母的质量检查

一、实验目的：学习酵母菌种的质量鉴定方法，

二、实验原理：酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。酵母活力强，发酵就旺盛；若酵母被污染或发生变异，酿制的啤酒就会变味。因此，不论在酵母扩大培养过程中，还是在发酵过程中，必须对酵母质量进行跟踪调查，以防产生不正常的发酵现象，必要时对酵母进行纯种分离，对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。

三、实验器材与试剂：显微镜，恒温水浴，温箱，高压蒸汽灭菌锅，带刻度的锥形离心管等

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