1%甲苯胺蓝配制：原液：1g甲苯胺蓝粉末+10ml 70%酒精溶解 （据说可保存6个月）
工作液：取上述原液1ml+9ml 1% NaCl 溶解，滤纸过滤 （用时新鲜配制） 1% NaCl：1gNaCl + 100ml 蒸馏水 （用时新鲜配制）
染色步骤：（1）爬片用PBS洗2次，直接用4% 多聚甲醛固定于6孔板中1h或更长时间（4度）
（2）自来水洗15分钟，最好不要直接冲爬片，易脱片 （3）蒸馏水洗5分钟 （4）加1%甲苯胺蓝浸染2h
（5）去除多余染液，我觉得可以用注射器从6孔板中吸走。有人说用90%酒精的，但一定要慎重。否则时间稍长，就会将颜色洗脱。当然洗脱后仍然可以从（4）开始重复。
（6）镜下观察，满意后晾干 ，中性树胶封片。
请教甲苯胺蓝多糖染色的原理
甲苯胺蓝是一种异染染料，可将多糖类（粘液）染成红色，而其余组织呈不同程度的蓝色，
这样增加了对比度。
当然其还可以染软骨、肥大细胞中的颗粒等。（红色）
3、 枸橼酸盐缓冲液 (Citrate buffer)： 3.1 储存液：
A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸 (C6H8O7·H20) 溶于1000ml蒸馏水中。 B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠 (C6H5Na3·2H20)溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液：
取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH 值应为6.0±0.1
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：
1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
(一) 原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
(二)操作方法及注意事项
1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
Percoll浓度(％) 70 60 50 40 30 20 比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
(三)分离纯化细胞举例
1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。 (四) 人不同血细胞的漂浮密度
表 人不同血细胞的漂浮密度
──────────────┬────────────────── 细 胞 漂浮密度 │ 细 胞 漂浮密度 ──────────────┼────────────────── 红细胞 1.09-1.11 │淋巴细胞 1.052-1.077 粒细胞 │ B淋巴细胞 1.062-1.075 嗜酸性 1.09-1.095 │ T淋巴细胞 1.065-1.077 嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母细胞 1.065-1.077 单核细胞 1.050-1.066 │自然杀伤细胞 1.050-1.070 血小板 1.030-1.060 │
──────────────┴────────────────── (五)问与答
问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?
答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg Percoll浓度(％) 70 60 50 40 30 20 比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
产品包装：前尘公司现货供应该产品 Product Percoll Percoll
产地
Product Code 17-0891-01 17-0891-01
Price（RMB） 3150 380
Pack sizee 1 L 100 ml
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【细胞培养】细胞同步化
2008年01月20日 星期日 下午 02:31
问：在培养细胞取材做其他检测时，为了各个培养瓶中的细胞的齐同性，常须通过同步而实现。具体方法不明，好象是用维持培养液（含较低浓度培养血清），而不是用生长培养液。
答：1.细胞同步化是指为研究细胞周期的不同阶段的生化特征,必须获得细胞周期一致性的细胞.因此,你首先看看是否需要用同步化的细胞
2.细胞同步化分为自然同步化和人工同步化二种方法,前者由于细胞群体受多种条件限制,对结果有很大影响，所以一般都采取后者.
3.常用的人工同步化法分为诱导同步化,选择同步化或两者结合.
1):诱导同步化法:
a.胸腺嘧啶阻断技术,先高浓度胸腺嘧啶培养细胞，使细胞不能通过S期,再改变其浓度，解除抑制,所有细胞都开始DNA合成，即获得同步化细胞.
b.中期阻断法,常用秋水仙素来抑制微管聚合,将细胞阻断在有丝分裂中期.此法不常用.
2)选择同步化法:
a有丝分裂选择法,这种方法主要是根据细胞周期的不同阶段的生理变化设计的方法.主要特点是可以获得一定数量的M期的同步化细胞，不受药物影响,同步化高，但获得细胞数量少，步骤多，且只能是在贴壁细胞中可以用.
b 细胞沉降分离法,主要用于悬浮细胞，其理论依据是细胞周期不同阶段的细胞体积不同.因为细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径的平方成正比.
用维持培养液（含较低浓度培养血清）可不是用来获得同步化细胞的哦!
问：用MTT法间接反映细胞增殖活性，是否需要细胞的同步化处理？
答1：如果你做的实验中干预因素是促进细胞生长的，我认为是需要做无血清或0.5%浓度血清（有些细胞无血清生长不好）同步化的；如果你做的实验中干预因素是抑制细胞生长的，那细胞无血清同步化就可以不是太严格要求。 但是尽可能使每组实验细胞处于G0期，或者在同一生长周期,这对于实验结果的可信度和可重复性是十分有好处的。
答2：作MTT时需要设定对照组，其他各组都分别和对照组比较，所以无需同步化。
答3 ：不需要的，因为已经有对照了。同步化反而加入了一个周期的干扰因素，不能反映生理状况了。
个人觉得不需要同步化，预实验时做过同步化，测出来的OD值都低于0.2，同步化是为了使细胞处于同一周期，而MTT与细胞周期没有关系
问：提取细胞蛋白时候，如果不进行血清饥饿同步化，有什么后果？
答：我觉得组间的蛋白表达量将无法比较,因为可能是由于血清刺激而导致表达量的不同吧
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