细胞生物学评价实验手册(2)

三、细胞形态检测（扫描电镜）

细胞材料复合物培养1d后，取出用2.5%戊二醛固定4h，1%四氧化锇后固定，梯度酒精脱水10min，临界点干燥，喷金后在扫描电镜下观察细胞形态。

四、细胞黏附增殖（MTT法）

（一）原理

MTT(噻唑兰)，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT转变为不溶于水的蓝紫色结晶并沉积在细胞内，结晶物能被二甲基亚枫（DMSO）溶解，用分光光度计或酶标仪检测490nm波长的吸光度，可间接反应细胞的数量。

（二）试剂配制

工作浓度：0.5g/l，可用1XPBS或未加酚红的培养基配制，宜现配先用（或半月内），4℃避光保存备用。

(三) 实验步骤

（1）在各时间点，细胞材料复合物用PBS洗两次，加入1ml MTT （0.5g/l）溶液，避光放入37°C, 5%CO2 培养箱孵育3h；

（2）将复合结构移入新的Eppendorf 管（避光），加入300ulDMSO,（混合器）震荡5min，离心5min（2000 rpm）；

（3）紫外分光光度计（或酶标仪）检测上清液490nm波长的吸光度（OD值）（1mlMTT工作液DMSO。

（四）注意事项

MTT及结晶溶解产物见光会快速分解，因此每一步均应避光。

五．碱性磷酸酶活性测定（骨）

（1）样本获取：

细胞支架复合物在成骨诱导液中培养3，7，14，21d时，用PBS洗两次，加

入300μl碱性磷酸酶裂解液，超声裂解4min，离心2min（13,000rpm），将上清液分装至4-5个EP管，冻存于-20℃用于总蛋白及碱性磷酸酶的检测。 （2）碱性磷酸酶测定：

样品解冻后离心，取20μl 加入200μl 5mM对硝基苯酚（p-nitrophenol），立即放入37℃水浴中，15min以后，加入1ml 0.02mM NaOH终止反应，紫外分光光度计检测反应物在405nm波长的吸光度（酶浓度）。

（3）总蛋白测定：

取30μl样品，加入150μl试剂A (一种碱性酒石酸盐溶液)，混匀后加入试剂B(一种稀释的蛋白定量试剂)，孵育15min，紫外分光光度计检测反应物在750nm波长的吸光度（总蛋白浓度）。

（4）碱性磷酸酶活性计算为酶浓度与总蛋白浓度之比。

六、糖胺多糖合成量测定（软骨）

BMSCs接种至酰胺化PHBV支架诱导成软骨培养时，同时设置BMSCs及软骨细胞复合酰胺化PHBV支架培养作对照，将BMSCs及软骨细胞1×107 cells/mL接种至相同大小的支架上。单纯BMSCs培养以低糖DMEM＋10?S液，软骨细胞以高糖DMEM＋20?S液进行复合培养。接种1周、2周及3周，分别收集三组细胞，裂解后以二甲基亚甲蓝分光法测定糖胺多糖(GAG)含量。方法如下：取500 μL细胞裂解液, 加入2.5 mL二甲基亚甲蓝溶液(二甲基亚甲蓝16 mg、甘氨酸3.04 g、氯化钠2.37 g、0.1 mol/L 盐酸95 mL，加水配成1000 mL溶液，调pH值为3.0)，充分混匀，用紫外分光光度仪(λ=525 nm)进行比色，以硫酸软骨素为标准品绘制标准曲线。

七、冰冻切片及染色技术

（一）冰冻切片技术

冰冻切片是利用物理降温的方法将组织标本冷冻使其产生一定硬度进行切片的技术方法，是脂肪染色、酶组织化学染色（如碱性磷酸酶染色和阿新蓝染色等）及免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是制片简单，

且能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜组织和已固定组织均可作冰冻切片。

试剂及配制： 0.01M PBS:

4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。

步骤：

（1）细胞支架复合物从培养基中取出（或新鲜组织），PBS洗两次，用包埋剂覆盖后快速冻存（减少冰晶形成）在-80℃或液氮中 20min以上用于随后的冰冻切片；

（2）载玻片上涂少量多聚赖氨酸，干片后备用

（3）组织块快速转移至冰冻切片机内，将组织切成5-10μm厚的切片，贴到准备好的载玻片上

（4）干片后用4%多聚甲醛在4℃固定20min，0.01M PBS洗三次，每次5-10min。（随后进行后续的酶组织化学染色或免疫组化染色，如果暂时不染色必须吹干后放在低温冰箱中备用，或预固定后储存低温冰箱中保存）

（二）冰冻切片碱性磷酸酶染色

续上

（5）加入BCIP/NBT染色液20min，用双蒸水洗去浮色，在显微镜下观察染色结果。

(三) 冰冻切片荧光免疫组织化学染色

（1）切片用4％PFA室温固定20min，PBS洗三遍，每次10min。 （2）0.2%Triton X-100/PBS室温处理30min。

（3）山羊血清封闭30～50min。

（4）去除山羊血清，不洗，直接加1:200一抗，4℃过夜。 （5）PBS洗三遍，10min/次。

（6）加入1：200 CY3偶联的山羊抗小鼠IgG，室温孵育45min。 （7）PBS洗三遍，10min/次。

（8）Hoechst33342衬染细胞核10～30min。 （9）荧光显微镜观察。

八、石蜡切片及染色技术

（一）石蜡切片制作基本技术

组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。 1.取材 应根据要求选取材料来源及部位。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。

2.固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。

3.洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。 4.透明 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。 5.浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆

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