细胞生物学评价实验手册(3)

好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。

6.切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。

7.贴片与烤片 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。 8.切片脱蜡及水化 干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。

9.染色（石蜡切片苏木精-伊红HE） 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖

体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。

步骤 ：（1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。（2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。（3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。（4）苏木精染液染色5～15分钟。（5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。（6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7）蒸馏水短洗。（8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。（9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。（10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。（11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再

加盖玻片封固

阿利新蓝染色（检测软骨）：①切片脱蜡至水洗；②蒸馏水洗；③1%阿利新蓝染液染色10~20分钟；④水洗2~3分钟；⑤用1%中性红染液复染胞核；⑥水洗2~3分钟；⑦逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

番红O染色（检测软骨）：①切片脱蜡，乙醇浸洗，水洗；②Weigert's苏木素中浸染3分钟，水冲洗；③盐酸乙醇液(1%盐酸加70%乙醇)中分化15秒；④水洗3分钟，0.02%水溶性孔雀绿中浸染3分钟；⑤1%醋酸中摆动洗涤；⑥0.1%的番红O中浸染不超过3分钟；⑦乙醇浸洗，梯度脱水，干燥，中性树胶封片，光镜观察。

石蜡切片Ⅰ型胶原免疫组化染色（检测骨） （1）石蜡切片在65℃烘烤1h

（2）二甲苯脱蜡 （3）梯度酒精水化

（4）微波中低火抗原修复20min （5）0.2%TritonХ-100室温下5min （6）1%H2O2室温下15min （7）血清封闭20min

（8）滴加1：200一抗，4℃湿盒孵育过夜，PBS洗涤5min×3次 （9）滴加生物化二抗，室温20min，PBS洗涤5min×3次 （10）滴加三抗，室温20min，PBS洗涤5min×3次

（11）滴加DAB显色，光镜下观察，反应时间3min，蒸馏水冲洗 （12）苏木素复染

（13）中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。

干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤

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来源:生物谷 时间: 2008-11-17 浏览人数: 4047

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碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也

是成骨细胞的标记物。 以ALP为目标物的检测方法：

1 Gomori钙钴法 【染色原理】

ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，

经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】

（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，

呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg

DMSO 0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml

六偶氮副品红0.5ml

1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与

等体积4%亚硝酸钠混合）

【步骤】

（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。 （5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：

【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生

萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】

取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过

滤到细胞爬片上。

【步骤】

（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2

分，晾干。

（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。

（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。

【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：

4 茜素红法

【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。

【步骤】 诱导液成分：DMEM完全培养基+地塞米松10-7mol/L +抗坏血酸50μg/ml + β-甘油磷酸钠10mmol/L，每2d换液一次。诱导第21天做茜素红染色观察钙结节

的生成。90%乙醇固定10分钟，去离子水漂洗3次。

（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。

（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。

（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。

【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

5 von Kossa法 【作用原理】

Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属

银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。 （2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。

（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。

（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。

（5）室温下晾干，封固。

下面引用由dozzy在 2003/01/04 02:35pm 发表的内容：

1、VON KOSSA 染色中脱水，是否仍是梯度酒精？ 2、能否介绍一下茜素红S法钙染色的详细方法

谢谢！！！！！

方法：1：切片常规入水。 2：茜素红染2min。 3：蒸馏水洗5-10s。 4：分化液洗15s。

5：常规脱水，透明，封固。 结果：钙 橙红，无机铁 紫色。

试剂：1 茜素红S(alizarin red S)液：茜素红S 0.5g加蒸馏水45ml,充分搅拌，同时加入

5ml稀释1:100的28% NH4OH,pH应为6.3-6.5，此液需保存至少一个月，方可使用。

2 分化液：取10~3mol/L HCl 混入到95%乙醇之中（即浓HCl 1份，95%乙醇10000份）

软骨细胞鉴定染色

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