荧光探针的合成及自由基检测研究 - 图文(9)

荧光探针的合成及自由基检测研究

2 结果与讨论

2.1 检测机理

在这次研究中，O2-·通过反应S2O42-+O2+4HO-=2SO32-+2H2O+O2-·制得[21],根据SO32--S2O4和O2-O2-·的标准和氧化还原电位计算[22]，反应平衡常数(K)和条件反应常数(K′)分别为7.6×1018和7.6×108。因此反应可以在O2碱性饱和溶液中自发反应完全，并且O2-·的浓度在0.10molL-1NaOH中可以至少维持1.5h。

因为H.Py.Bzt与O2-·反应形成强荧光产物，所以O2-·数量可以通过测量荧光强度变化来直接检测。根据这种方法所得到的激发和发射光谱记录在(图1)，荧光强度使用λex/em=377/528nm。结果表明H.Py.Bzt本身没有荧光而在氧化反应发生后荧光强度显著增加。但H2O2不能氧化该探针(图1(3))同样数量的羟基自由基(HO·)在同样的测量波长下也不能改变荧光强度(图1(4))。虽然10倍数量的HO·可以使荧光强度增加，实际上HO·源自O2-·并且只能以10-8molL-1的极低浓度持续10-4s[23]，但是这种HO·数量以现有的生物体内不能达到这么高数量的O2-·。此外，H.Py.Bzt捕捉O2-·的反应敏感而迅速。因此HO·将不会在实际样品中干扰O2-·的检测。所以这种探针可以针对识别O2-·并且该方法在活性氧的检测中有更好的选择性。

为了研究反应机理，合成氧化产物；0.050gH.Py.Bzt溶于10ml乙醇中，2.00gNa2S2O4溶于10mlNaOH中(0.10molL-1)，将其混合，并加入适量缓冲溶液。然后除去溶剂，残留物用二氯乙烷洗。得到粗产物绿色固体。乙醇中重结晶得到纯的棕色产物。[熔点：131-132℃。1H NMR(90MHz，DMSO-d6，25℃，TMS)：δ7.6-8.6(4H，pyridine-H)，7.3-7.6(4H，benzol-H)。IR(KBr压片)：ν(cm-1)1637(C=N)，3105(C-H)，1595(C=C)。元素分析(%)计算C12H8N2S(实际值)：C67.90(67.92),H3.75(3.77),N13.26(13.21)]。如1H NMR图谱显示，对应于H.Py.Bzt中N-H(4.3)和C-H(6.3)的峰消失并且其它信号移动到较低的区域，表明该产物具有较大的共轭体系。这也可以解释荧光强度增加的原因。在红外图谱中，N-H(3250cm-1)和C-H(3105cm-1)消失而C=H在1673cm-1的吸收带出现。所有光谱

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数据与方案3中的结构Ⅱ一致。该结构通过元素分析进一步证实。因此，该机制可以推测如下：

O2-·通过去氢氧化该探针得到有更好的稳定性和更大的共轭体系的化合物2-(2-吡啶)-苯并噻唑(方案3，Ⅱ)(S上的自由电子对同样与苯环共轭)。由于它更大的共轭体系，荧光强度在探针与O2-·反应后显著增加。

要确认是由碱性Na2S2O4获得的O2-·使荧光增强，我们用几种含硫的化合物进行了测试。结果表明Na2SO4，Na2SO3和Na2S均不能使荧光强度增加。我们同样测试了使用中性和碱性Na2S2O4与H.Py.Bzt反应，结果表明荧光强度在中性水溶液中不会改变而在碱性溶液中显著增加。这些测试证明只有产生O2-·的碱性Na2S2O4溶液可以氧化该探针并且使荧光强度增高。为了进一步验证该结论，使用邻苯三酚产生O2-·与探针反应。结果显示与碱性Na2S2O4相同(图2)并且由于邻苯三酚的缓慢自氧化速率，荧光强度增加更加持久。这样的结果表明碱性Na2S2O4溶液中存在O2-·，这也可以通过SOD清除O2-·的实验证实。与通过邻苯三酚自氧化产生O2-·比较，碱性Na2S2O4更为迅速，所以没有必要考虑时间对测定的影响。这不仅避免了实验错误也改进了实验速度。

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2.2 多参数优化

优化的多方面参数为取样、注射时间和停止流动，流速，注射体积。实验中所用试剂是流动的1.20×10-3molL-1 Na2S2O4，5.00×10-3molL-1H.Py.Bzt，以及Na2B4O7-NaOH(pH9.20；0.10molL-1)缓冲溶液作为载体。 2.2.1 注射体积影响。

H.Py.Bzt注射体积从50到300μl多次取样。截过表明相对荧光强度随注射体积增加而升高，而△F从200至300μl几乎不改变(图3)。同时，更大的注射体积意味着更低的样品通量。为了同时保证敏感度和样品通量，选择200μl。 2.2.2 流速影响。

反应器为一段PTFE管(250cm长，内径0.80mm)。流速是样品通量的重要因素。实验中流速通过改变泵转速调整。结果表明△F在转速为25-30转每分时达到最高并且稳定；30转每分时基线稳定并且峰型良好。所以转速采用30转每分，载体流速，H.Py.Bzt，Na2S2O4，和SOD分别为1.60，2.40，2.20ml每分钟。

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2.2.3 采样和注射时间的影响。

我们使用不同的采样和注射时间测试了敏感度和峰型。结果表明它们分别是15s和50s时△F最高并且峰型更好。停止流动的时间同样进行了测试。结果表明停止流动的时间对△F没有影响。这表明该反应非常迅速；由于这样的反应速率它可以在一瞬间完全反应，所以时间对检测没有影响。这可以减少由于测定时间带来的误差。由于反应时间对测定没有影响，不需要停止流动，这也就缩短了检测时间并且改进样品通量。因而，这种方法达到每小时55个样品的通量。

2.3 pH的影响

图4表明，结果显示在8.90-10.00的范围内是产生O2-·的最佳pH。相比较而言，Na2B4O7-NaOH比NH4Ac-NaOH，NH4Cl-NH3·H2O和Tris-HCl缓冲溶液体系内更敏感。因而选择Na2B4O7-NaOH缓冲溶液(pH9.20,0.10molL-1)作为载体。

2.4 反应物浓度优化

Na2S2O4的浓度决定O2-·的产量。试验结果表明△F与Na2S2O4在0.00至1.10×10-3molL-1间呈线性关系并在Na2S2O4浓度达到1.20×10-3molL-1时达到稳定(图5)。所以实验中Na2S2O4浓度选择1.20×10-3molL-1。

因为H.Py.Bzt是O2-·的捕捉剂，它的浓度直接决定O2-·是否能被完全捕获，这也就决定了该方法的准确和敏感程度。△F随捕捉剂浓度升高而升高并且在H.Py.Bzt达到4.50×10-3molL-1时达到平衡(图6)。因此H.Py.Bzt的注射浓度取5.00×10-3molL-1。

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