荧光探针的合成及自由基检测研究 - 图文(8)

荧光探针的合成及自由基检测研究

译文及原文

2-(2-吡啶)-苯并噻唑荧光探针对超氧阴离子自由基的流动

注射荧光光谱测定的研究和应用

摘要

这篇论文展示了一种用新型的命名为H.Py.Bzt（2-(2-吡啶)-苯并噻唑）的荧光探针检测超氧化合物歧化酶(SOD)活性的全自动化的荧光光谱检测法(流动注射荧光检测法)。这种荧光探针可以在室内合成，并且同时充分具有元素分析和红外光谱、质谱核磁共振的特点。它可以专门鉴别并捕获O2-?并且被其氧化成一种强力的荧光产物。以此反应为基础，这种流动注射荧光光谱检测法被设计并成功用于检测SOD的活性。我们所推荐的这种方法在氧化物反应进程上有更好的识别性，因为这种探针只能被除H2O2以外的O2-·氧化。作为一种简单，迅速，精确，敏感并且全自动化的技术，它在对葱、蒜、洋葱中SOD活性的测量中取得令人满意的结果。

关键词：超氧阴离子自由基(O2-·),2-(2-吡啶)-苯并噻唑,荧光探针,流动注射荧光光谱法,SOD

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荧光探针的合成及自由基检测研究

各式各样的游离自由基在生物体新陈代谢期间产生，例如超氧阴离子自由基(O2-·)，羟基自由基(HO·)，ROO·，这是典型的3种自由基[1]。游离自由基，尤其是O2-·，在过去几年内，O2-·被认为在心肌缺血和再灌注损伤中广泛存在[2]。过多的O2-·，即有毒性反应活性的氧，对光合色素和薄膜有巨大伤害，并对整个光合系统有进一步的伤害。而且，O2可以转化为更大毒性的自由基，如HO·，H2O2，

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O2等[3]，这会伤害光合作用薄膜和许多生物分子。此外，O2-·会造成冠心病，动

脉硬化，肿瘤等疾病[4-6]。出于这些原因，从生物体中排除O2-·对阻止疾病和衰老有重大意义。

众所周知超氧歧化酶(SOD)1是O2-·的清除剂和生物体中O2-·数量的重要指示剂。因此建立一种精确，迅速并敏锐的检测SOD活性的方法具有重大的应用价值。目前，检测SOD活性的常用方法是焦棓酸的自身氧化[20]和次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(HX-XO)-细胞色素的还原[7]，这两种都属于分光光度法。近几年来，一些新的方法如化学发光法(CL)[8]，电子自旋共振法(ESR)[9,10]，高效液相色谱法(HPLC)[11]，极谱氧电极法[12]和免疫法已发展成熟。然而，所有这些方法都有所不足；例如，ESR的仪器需求非常昂贵，HPLC的操作很复杂，CL的选择性匮乏，分光光度法敏感度很低。比较之前提到的几种方法，荧光光度法更加简便，敏锐和更具选择性。然而，至今只有为数不多的几篇使用荧光光度法检测SOD活性的报告。流动注射检测(FIA)方法具有更好的重现性和更为迅速的验定速度，这可以实现实时，在线和全自动化样品验定。所以FIA和荧光光谱法结合同时具有荧光法的特点和流动注射检测的优势。现在，FIA-荧光光谱法[14,15]和FIA-化学发光法[16,17]已经在自由基检测中获得应用，但应用于检定自由基和SOD活性的FIA-荧光检测法还没有报道。

在这篇文章中，一种命名为2-(2-吡啶)-苯并噻唑(H.Py.Bzt)，可在室内合成的新型荧光探针，通过流动注射法应用于O2-·鉴别和SOD活性检测。在实验中，我们发现O2-·可以氧化H.PY.Bzt形成一种强效的荧光探针，并且H2O2不会对此有影响。此外，同等数量的氢氧根自由基(HO)也同样对检测O2-·无影响，因为在它反应系统发生变化时的测量波长中不会产生荧光强度。所以这种探针有更好的选择性。此外，我们所推荐的这种方法在我们所处理的55种样品中体现出自动化和迅速的特点。它在应用于葱，大蒜，洋葱中SOD活性检测中获得成功。

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1 实验部分

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

荧光的光谱和强度使用一台装有氙灯和18微升石英贯通池(Varian,澳大利亚)的荧光分光光度计测量。流动注射器配有一个八通道同时开动的注射阀和同时使用的两台蠕动泵(FIA-3100，北京万托，中国)。所有pH的测量使用一台pH-3c数字pH测量仪(上海雷茨装置工程，中国)。红外光谱使用一台PE-983红外光谱仪(KBr压片，Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA)。元素分析使用PE-240CHN分析仪进行。HNMR使用FX-90Q核磁共振仪记录(溶剂使用DMSO，JEOL，日本)。吸光度使用一台UV-265分光光度计(日本)测量。 1.1.2 试剂

5.00×103molL荧光探针(内部合成)以适当2-(2-吡啶)-苯并噻唑溶解于乙醇中备用。Na2S2O4溶液(1.20×103molL-1)以适量Na2S2O2溶于0.10molLNaOH溶液中备用。储备好的SOD溶液(1.00×102gL-1)溶于水中备用(放在冰箱中)。使用KMnO4标定过的H2O2溶液(1.20×103molL)。下列溶液在二次蒸馏水中准备:邻苯三酚，3.00×103molL；Na2B2O7-NaOH(pH9.20)，0.10molL-1)缓冲溶液，Tris-HCl(pH8.20)，0.10molL-1)缓冲溶液。Fluka公司的2-吡啶甲醛和邻氨基苯硫醇。所有化学药品为分析纯级别，使用双蒸馏水。 1.1.3 H.Py.Bzt的合成及性能

2-(2-吡啶)-苯并噻唑以适量2-吡啶甲醛(0.03mol)和邻氨基苯硫醇以1：1摩尔比缩合。合成反应图在图1中展示。混合溶液需要加热回流约2-3h。之后减压蒸馏除去溶剂即可出现黄色粗品，然后使用甲苯重结晶并真空干燥。[熔点：80-81.5C。H NMR(90MHz,DMSO-d6,25C,TMS):δ 6.3 (s, 1H, C–H), 4.3 (s, 1H,N–H), 7.2–8.5(4H, pyridine-H), 6.6–7.2 (4H, benzol-H)。 IR (KBr压片): ν(cm-1) 3250 (N–H), 3105 (C–H), 1595 (C=C)。元素分析计算值 C12H10N2S (实测值): C67.24 (67.31), H 4.70 (4.81), N 13.70 (13.60).] 这些数据与 [18,19]中的报告值相同。

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表1 流动注射操作规程

过程a 阀位置 时间(s) 泵(A)转速(min-1) 泵(B)转速(min-1) 1 F 15 30 30 2 I 50 0 30

a

五次循环

1.1.5 流动注射合成装配

流动注射已经通过初步测试得到优化，之所以选择图2中的装配法是因为这种配置设计是可以同时满足峰高和峰型的最好折衷办法。使用这种设计时，荧光探针在达到一个称为反向注射值时注入。因为Na2S2O4溶液要每2h配制一次并且探针需要保持在一个稳定的状态，反向注射可以节省荧光探针并且峰型比常规注射更好。操作计划在表1中展示。

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1.2 实验程序

1.2.1 O2-·和SOD活性测定。

探针试剂(R)通过蠕动泵P(A)和P(B)注入载流蒸汽(C)中与用来制造O2-.的碱性Na2S2O4(S1)混合。H.Py.Bzt迅速被O2-·捕捉并出现强荧光产物。测量所得荧光强度与空白试剂对比λex/em=377/528nm(S1为0.10mol·L-1NaOH溶液，S2是水)。相对荧光强度与O2-·数量成正比。实验参数设置如下：进样量200μl；反应管长度250cm(内径0.80mm)；采样和注射时间分别为15s和50s；泵转速为30转每分。

测定SOD活性时，提取S2蒸汽(0.20ml稀释到10ml)。设SOD数量P(参考O2-·消除作用测定)达到50%作为一个单位，SOD活性的计算公式如下：SOD活性(Uml-1)=PVTn/(50%VM)，VT是被检测溶液的总体积，VM是所提取SOD的体积，n是所提取SOD被稀释的倍数(VT/ VM)。SOD活性的单位可以根据SOD在样品中的含量可以转换为Ug-1。 1.2.2 O2-·消除作用测定。

当一定浓度SOD标准溶液流过S2时荧光强度记为Fs；只有一定量Na2S2O4溶液流过S2时荧光强度为F；当SOD和Na2S2O4均未被添加时荧光强度为F0.SOD对超氧阴离子的清除率(P)计算公式为P=(F-Fs)/(F-F0)×100%。 1.2.3 从样品中提取SOD。

葱，大蒜和洋葱去皮、根，洗净，空气中放干；每个样品取1.0000g并与2.00ml磷酸盐缓冲溶液(pH7.80；0.050molL-1)混合，冷冻2h后捣成糊状，稀释至8ml，持续冷冻1h，离心(4000rpm)15min。上清液转移入三支离心管中，加入冷的乙醇(0.50ml)和氯仿(0.50ml)。混匀后离心5min。上清液为SOD提取物，存放于冰箱中。 1.2.4 通过邻苯三酚的自动氧化检测SOD活性。

10ml比色管中加入5ml Tris-HCl(pH8.20)缓冲溶液，0.30ml邻苯三酚(3.00×10-3molL-1)，以及0.20mlSOD提取物[20]。使用双蒸馏水稀释至刻度。溶液混匀后在320nm处与空白试剂对比测量荧光。25℃时，抑制邻苯三酚自动氧化速率至50%min-1ml-1的SOD数量定义为SOD活性单位(Uml-1).SOD活性计算公式如下：SOD活性(Uml-1)=[(υp-υs)/(υp×0.5)]×VTn/υs, υp为邻苯三酚自氧化率，υs是样品的自氧化率，VT是被测溶液总体积(ml)，n是SOD提取物稀释倍数。SOD活性单位可以根据样品中SOD含量转换为Ug-1。

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