适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术(3)

重复基因外回文序列分析技术（Repetitive-ElementPCR，REP-PCR）是以PCR为基础发展起来的一种针对原核生物的DNA指纹图谱技术。REP-PCR技术的原理是利用特定的引物扩增细菌基因组DNA的重复序列,这些序列在进化过程中高度保守，扩增位于这些序列之间的不同区域可得到不同的图谱，扩增产物经凝胶电泳便可以分析其多态性。经实践研究证明该方法具有简便快捷、重复性好、分辨率高等特点，所以这项技术也成为一种鉴定乳酸菌的新方法。

2001年，FranciseBerthier等对当地两个干酪厂生产的八块干酪中的488株嗜温乳杆菌运用ERIC-PCR技术进行了分类鉴定，其鉴定结果显示，这488株嗜温乳杆菌可以被分为3个种群，其中副干酪乳杆菌（L.paracasei）是超级优势菌群，占到了总数的98.7%。Ventura等采用多种分子标记方法对16株约氏乳杆菌进行分类研究，其中用ERIC标记分为6个亚类，用REP-PCR标记则分为4个亚类，AFLP标记分为7个亚类，ERIC标记与AFLP标记比较有90%-96%的相似性，这也表明这些分子标记技术具有多重共线性。

因为DNA探针技术方法特异、敏感又没有放射性，且不需要进行复杂的纯培养和扩培菌等过程，所以在微生物的鉴定方面应用前景广阔。

DNA探针技术的原理是：两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列,就能够特异性的结合而形成分子杂交链。若在已知的DNA或RNA片段上加上可识别的标记（如用32P同位素标记、生物素标记），就可制成DNA探针，用以检测未知样品中是否有与其互补的基因序列，并可进一步判定其与已知序列的相同程度。乳酸菌DNA探针技术是指利用限制性内切酶消化DNA后再用DNA探针来检测产生的DNA片段。DuToit利用DNA探针技术从297株乳杆菌中成功筛选出了益生菌。2003年，Stackebrandt等也应用此项技术对采自当地酸牛乳中的48株乳杆菌在种的水平上成功进行了分类鉴定，鉴定结果表明干酪乳杆菌（L.casei）是明显的优势菌群。

基因芯片是利用核酸杂交原理对未知分子进行检测。将核酸或核酸片段按照一定顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列。按照其结构基本上可分为两种类型：一种是将待测DNA分子样品固定在固相支持物上并与一系列游离的标记探针杂交，杂交探针或是单一的或是混合的；另一种是按照预先设定顺序将寡核苷酸固定于固相支持物上，再与标记的DNA样品进行杂交，然后由已知的寡核苷酸序列确定被检测的DNA样品。

具体做法是将固相介质（如玻璃片）通过适当机制进行位置固定，再利用高速机械手和连续点样技术将多个DNA均匀地点在固相介质上，为使点样精度保持恒定，要求多针头具备单次取样、连续点样的功能，且自动取样的同时保证高通量和高精度，然后由系统直接通过程序控制连续点样操作。信号的强弱由共聚焦的芯片检测器测量。2006年，BernardBerger等人[27]对12株嗜酸乳杆菌群（L.acidophilusgroup）应用基因芯片技术以及其他分子标记技术进行了分析研究，结果清晰阐释了这一嗜酸乳杆菌群之间的相似性和细微差异性。

8展望

分子生物学技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段，但是还没有任何一种分子生物学技术可以单独用来鉴定乳酸菌；而传统的表型、生物化学方法鉴定乳酸菌耗时耗力，鉴定结果不稳定，只有将分子生物学方法和传统鉴定方法结合起来鉴定乳酸菌才会更加准确。不难想象，随着技术手段的不断改进、实验操做的逐步规范以及商品化试剂盒研制进程的加快，分子生物学技术必将在乳酸菌的分类鉴定以及进一步研究中发挥更大的作用。

7基因间重复序列分析技术

1990年，Sharples等在对Escherichiacolitls菌株基因组中ds的3’末端区进行分析时首次发现了ERIC片段，命名为“基因间重复单位[IRU（In－tergenicRepetitiveUnit）]序列。随后，Hulton等也鉴定出了相同的重复序列，并命名为肠细菌基因

《乳业科学与技术》2009年第2期（总第135期）93

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