适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

《乳业科学与技术》

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2009年第2期（总第135期）89

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综述

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

摘要：介绍了几种适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学方法及其原理、优缺点和研究现状。关键词：分子生物学技术；乳酸菌；分类鉴定

中图分类号：TS252.1

文献标识码：A

文章编号：1671-5187（2009）02-0089-05

ReviewontheMolecularBiotechnologyfortheClassification

andIdentificationofLacticAcidBacteria

ZhangJiachao,SunZhihong,LiuWenjun,ZhangHeping*

（KeyLaboratoryofDairyBiotechnologyandEngineering,MinistryofEducationHuhhotof

）InnerMongolia010018,P.R.China

Abstract:Theprinciples,methodsandapplicabilityofmolecularbiotechnologyusedforclassificationandi－dentificationoflacticacidbacteriawerereviewed.

Keywords:molecularbiotechnology;lacticacidbacteria;classificationandidentification

乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌，乳酸菌的自然宿主是人类、动物和植物，在发酵过程中的关键代谢产物是乳酸。由于其代谢产

物对人体健康有益，所以在各类食品中，如酸牛乳、干酪、巧克力和各类保健药品中得到了广泛的应用。

分类鉴定是微生物学的一个重要领域，建立一套精确快速的分类鉴定方法具有重要的意义。传统的微生物分类鉴定方法是利用形态学和生理学特征及其差异来进行的，但是这种经典分类学方法的弊端是耗时耗力，并且在区分一些形态相近的菌株方面存在局限性[1]。随着分子生物学的飞速发展，从分子和基因水平来鉴定乳酸菌已

成为可能,许多新的分子生物学技术正在被用来进行乳酸菌的分类鉴定，如16SrRNA基因间隔区（IntergenicSpacerRegion，ISR）的序列分析技

术、随机扩增多态DNA技术（RandomlyAmplifiedRAPD）、变性梯度凝胶电泳标PolymorphicDNA，

记技术（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性分析技术（Re－strictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性分析技术（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）、DNA芯片技术、肠细菌基因间重复共有序列分析技术（Enterobacte－rialRepetitiveIntergenicConsensusSequences,ERIC）以及重复基因外回文序列分析技术（RepetitiveExtragenicPalindromicSequences,REP）。本文将就以上几种分子生物学技术的方法原理以及各自的优缺点进行阐述。

收稿日期：2008-08-07；

作者简介：张家超，男，硕士，研究方向为乳品生物技术；*通讯作者：张和平，男，教授，博士生导师；基金项目：国家自然科学基金项目（30660135，30760156），教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目（NCET-06-0269），国家科技基础条件平台建设项目（2005DKA21208-12）。

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适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

张家超，孙志宏，刘文俊，张和平*

116SrRNA序列分析

原核生物含有3种类型rRNA：23S、16S和

5SrRNA，它们分别含有2,900，1,540和120个核苷酸。5SrRNA虽然容易分析，但是核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；而23SrRNA

90张家超等：适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

菌中的46株应用传统生理生化方法和RAPD-PCR技术进行了遗传学特征分析，研究结果表明RAPD-PCR技术更能显示出这46株植物乳杆菌

之间的同源性。UlrichSchillinger等[10]从酸乳酪中使用RAPD-PCR技术与11分离出20株益生菌，

株模式菌株电泳图谱进行比对分析，鉴定出这20株菌属于嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）和干酪乳杆菌（L.casei）。G.Spano等[11]从红葡萄酒中分离出一株能产生瓜氨酸和氨，并能起到降低精氨酸作用的菌株，经过RAPD-PCR技术鉴定为植物乳杆菌（L.plantarum）。Hayford等[12]也用此方法对玉米发酵进行研究，发现在玉米发酵中的优势菌种是发酵乳杆菌（L.fermentum）。

含有的核苷酸几乎是16SrRNA的两倍，分析十分困难。通过大量的研究证明16SrRNA的全长约为1540bp，片段长度适中信息量较大且易于

分析。

上个世纪60年代末，Woese首次采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，通过比较各类生物细胞的核糖体RNA特征序列，认为16SrRNA序列作为微生物分类鉴定的依据最为合适。因为rRNA结构既具有保守性，又具有可变性。保守性能够反应生物物种的亲缘关系；可变性则能够揭示出生物物种的序列差异，是种属鉴定的分子基础[2]。在对16SrRNA序列进行测定后，可以通过序列比对分析来完成其种属归类。

近几年，随着测序技术的日益成熟以及测序的市场化，使得16SrRNA序列分析技术在乳酸菌鉴定中得到广泛应用。P.Parola等应用16SrRNA序列分析技术，通过分析序列成功分离鉴定出了败血病人体内的干酪乳杆菌（Lactobacillus

[3]

3变性梯度凝胶电泳标记技术（DGGE）

1979年Fischer和Lennan[13]最先提出了用于检测DNA突变的一种电泳技术———变性梯度凝

胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）技术。1993年Muzyer等[14]首次将DGGE技术应用于微生物研究，并证实这种方法用于微生物种属鉴定是十分有效的。

DGGE的基本原理是：DNA分子中4种碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链DNA分子具有不同的解链温度。当双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小，从而使具有不同序列的。DNA片段滞留于凝胶的不同位置，结束电泳时，只要选择的形成相互分开的带谱。理论上认为，电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，一个碱基差异的DNA片段都可以被区分开。

2007年，MilicaNikolic等人[15]通过PCR-DGGE的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸菌。2006年，G.Spano等[16]运用DGGE技术成功分析了红葡萄酒中的酒类酒球菌（Oenococcusoeni）和植物乳杆菌（L.plantarum），并指出植物乳杆菌（L.plantarum）是发酵初期的优势菌种。KingsleyCAnukam等[17]运用DGGE技术和16SrRNA序列分析技术相结合的方法对采自尼日利亚健康女性阴道的241株乳酸菌进行了鉴定，鉴定结果表明惰

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