适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术(2)

）是优势菌株，占64%，另外有性乳杆菌（L.iners

7.3%属于加氏乳杆菌（L.gasseri），有6%属于植物

casei）。2002年Booysen等[4]将分离自麦汁中的乳

酸菌进行了分类研究，通过对其16SrRNA序列分析，成功的对实验菌株在亚种水平上进行了鉴定和区分。乌日娜等[5]结合传统生理生化鉴定方法与16SrRNA序列分析技术将实验室一株益生菌鉴定为干酪乳杆菌（L.casei）。2001年，Corseffi等[6]同样运用16SrDNA序列分析技术，成功的对分离自25个小麦酸面包中的317株乳酸菌在种的水平进行了分类鉴定。2000年TerenceR等对

[7]

猪排泄物中的一种能够产抗生素的菌株进行了DNA序列分析，在分析其16SrRNA序列的同时进一步对其4232bp质粒进行分析，最后以16SrRNA基因大于99%的同源性将其鉴定为罗伊乳杆菌（L.reuteri）。

2随机扩增多态DNA技术（RAPD）

随机扩增多态性DNA（RandomAmplified）标记技术是由PolymorphismDNA,RAPD

Williams[8]和Welsh同时发展起来的一种分类鉴定方法。它的基本原理是利用随机引物（一般为8-10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后应用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，来完成其进化遗传分析。在应用中RAPD技术的优点是简单便捷，在不知道基因组DNA的任何序列信息的情况下就可以进行鉴定；缺点是重复性差，鉴定结果不稳定，很难在种以及亚种的水平上准确鉴定。

2007年IsabelLopez等[9]对120株植物乳杆

《乳业科学与技术》2009年第2期（总第135期）91

乳杆菌（L.plantarum），有3%属于卷曲乳杆菌（L.crispatus），有2.7%属于鼠李糖乳杆菌（L.rhamno－sus），有2.7%属于阴道乳杆菌（L.vaginalis），有

1.3%属于发酵乳杆菌（L.fermenti），有1.3%属于），有1.3%属于唾液乳杆瑞士乳杆菌（L.helveticus菌（L.salivarus）。Randazzo等[18]也报道了将DGGE分析与RT-PCR相结合的技术来研究干酪生产过程中微生物的构成和代谢活性。

尽管DGGE电泳技术在研究群落动态和多样性方面存在很多优势，但是该技术无法给出代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。因此必须与其它技术相结合才能弥补不足。

测整个生物基因组的多态性。

AFLP的基本原理是对基因组DNA酶切片段进行选择性扩增,将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不

首先使用同扩增片段长度的多态性。一般而言，两种不同的限制性内切酶对整个基因组DNA进行酶切反应，然后将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特异人工接头在T4连接酶的作

用下进行连接，形成选择性扩增的模板，然后用带有选择性碱基的特异引物进行选择性扩增。为使得扩增效果更好，反应一般分两步进行，即预扩增和选择性扩增，最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经EB染色或银染后，清晰呈现片段长度的多态性。该技术建立初期用于植物育种的研究，后来发展成为可以分析任何来源DNA指纹图谱的一项通用技术，近些年来被广泛的应用于乳酸菌的分类鉴定。2007年MatteoBusconi等[25]首次应用AFLP技术对小牛肠道中的乳酸菌菌群进行了分析，他们选取了两只健康小牛肠道中的311株乳酸菌使用该技术完成了分类鉴定，这些乳酸菌被无一例外的分类到8个属，其中最具代表性的是乳杆菌属（169株），其次是链球菌属（99株）。同年，ZhechkoPanayotovDimitrov等对49株分离自健康人类排泄物的乳酸菌进行了分类鉴定，通过对比使用RAPD、PFGE以及AFLP三种分子生物学技术得出结论：RAPD技术是最迅速最便捷的技术，但是重复性不好，鉴定结果不甚准确；PFGE技术虽然鉴定结果稳定且准确，但是耗费人力物力财力最大，实施起来比较困难；而AFLP技术操作相对简单便捷，而且鉴定结果准确，完全可以在种的水平上甚至于亚种的水平上对乳酸菌准确分类鉴定，因此AFLP技术必将成为乳酸菌鉴定的强有力的工具。2001年Torriani等[26]使用AFLP技术成功区分开了植物乳杆菌（L.plantarum）、戊糖乳杆菌（L.pentosus）和类植物乳杆菌（L.paraplan－tarum）。Ventura采用AFLP技术，不经过预扩增，在其中一个预扩增引物加上一个选择性核苷酸组成一对引物，将47株约氏乳杆菌（L.johnsonii）为7个亚类。

4限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）

上个世纪八十年代，Bostein[19]首先提出利用

限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）作为标记构建遗传图谱。RFLP基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割基因组特定片段的PCR扩增产物，得到大小不等的DNA片段,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些片段，便可以获得个体的差异，从而达到鉴定辨别的目的。

最近几年，PCR与RFLP相结合的技术被普遍的应用于乳酸菌的分类鉴定中。2003年，ElifYavuz等[20]应用RFLP技术对分离自当地的酸酪中的150株乳酸菌进行分类研究，并与九株标准菌株RFLP图谱比较分析，在种的水平上对其进行了鉴定。JohnW等[21]应用PCR-RFLP对拟南芥中的细菌群落进行了菌群分析，通过与模式参考菌株比对，将分离细菌进行了鉴定，其中植物乳杆菌（L.plantarum）为优势菌群。2002年GiraffaG等人[22]对分离自当地不同乳制品中的35株德式乳杆菌（L.delbrueckii）和保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）在亚种水平上进行了鉴定；并通过比较使用RFLP蛋白基因编码技术与16SrRNA序RFLP蛋白基因编码列分析技术最终得出结论，

技术在亚种水平的鉴定中较之16SrRNA序列分析技术更为有效。Randazzo等[23]应用此技术对分离自绿橄榄中的部分乳酸菌进行研究，发现大部分菌株为干酪乳杆菌（L.casei）和短乳杆菌（L.brevis）。

5扩增片段长度多态性分析技术（AFLP）

1993年荷兰科学家Zabeau和Vos[24]率先提出并发展建立起来一种DNA多态性分析的新方（AFLP），它可以用来检法—扩增片段长度多态性

6DNA探针技术及芯片技术

DNA探针技术是20世纪70年代在基因工

程学基础上发展起来的一项新技术，又称核酸分子杂交技术，具有敏感性高和特异性强等特点。

92张家超等：适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

间保守重复序列（EnterobacterialRepetitiveInter－genicConsensus，ERIC）。

ERIC的中心有一段保守性很高的反向重复

序列,该序列长约44bp。Versalovic等以ERIC的核心序列设计了一对反向引物（ERIC15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′），认为ERIC-PCR扩增的是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域,由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱。此后，这项技术就被广泛用于细菌分类和菌种鉴别。

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