生技作业

植物保护生物技术论文

学生姓名徐冬冬 学号2012512100 专业植物保护

年级、班级2012级（2）班 所在学院农学院

通过转抗生素基因使棉花获得黄萎病拮抗能力的设想

摘要：棉花黄萎病属于土传病害，特点是分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多植物体外存活时间长。由于棉花黄萎病菌变异性较大，给棉花黄萎病的防治造成一定的困难。目前防治棉花黄萎病的主要方法是培育抗病品种、使用化学药剂和利用农业措施等，但防病效果都不理想。转基因技术的出现为棉花的转基因育种提供了希望，利用拮抗放线菌的抗生素基因并将其倒入到棉花体内，提高棉花自身的抗病性从而达到防治黄萎病的目的。 关键字：棉花黄萎病转基因防治

棉花是世界性的重要经济作物，世界纺织工业年耗原棉约占纺织原料的60%，占国际市场纤维类消费量的一半以上，棉籽油是很好的优质食用油，占世界植物油的10%左右，棉仁含蛋白质30%-35%，是蛋白质的重要来源，低酚棉棉仁粉可作为高级食品添加剂。棉杆粉碎后可作为牲畜粗饲料和工业原料等。我国城乡人民的衣着被絮，约有70%来自棉花。

棉花黄萎病是分布于世界各主要产棉国的主要病害,1914年首先在美国弗吉尼亚州的陆地棉上发现。目前该病害已遍及美国、中国、印度、哈萨克、乌兹别克、巴西、秘鲁、墨西哥、阿根廷、澳大利亚、土耳其、乌干达、坦桑尼亚、津巴布韦、南非等几十个国家。在前苏联,以70年代初推广的抗病品种面积估计,棉花黄萎病面积约有133万hm2,占棉田总面积60%左右,每年因黄萎病使许多高产棉田减产25%～30% ,仅1966年就损失原棉5亿公斤。美国在1952～1990年近40年中,平均每年由于黄萎病危害而损失全国棉花总产的2.23%。我国的棉花黄萎病自1935年由引进美棉而传入。 1973年普查,全国枯、黄萎病面积36.98万hm2,占统计棉田的10% ,1977年扩大到57.24万hm2,占统计棉田的12. 12% ,1979年增至71.17万hm2,占统计棉田的18.2%。1982年农牧渔业部对全国棉区进行普查,枯、黄萎病发生面积达148.2万hm2,占当年植棉面积的31.26% ,其中纯黄萎病棉田面积13万hm2,占病田面积的8.7%。截至80年代末,棉花黄萎病已遍及我国18个省(市、自治区)的478个县(市)。20世纪90年代以来,我国棉花黄萎病蔓延迅速。据1993年调查估测,全国黄萎病发病面积达270余万hm2,

损失皮棉10万吨。 1995年,我国北方棉区(如河北、山东、山西、陕西等)黄萎病大发生,损失皮棉7.5万吨左右。 1996年河南省黄萎病发生面积约40余万hm2,重病田12万hm2,有些主要产棉县的重病田出现大量病株落叶成光杆的现象,一般减产30%～ 50% ,严重的高达70%。一些地区几乎每年都有黄萎病严重发生,而且逐年严重。以上情况表明,在棉花高抗黄萎病优良品种普遍推广之前,黄萎病的发生是很难得到有效控制的。黄萎病给世界植棉业造成严重威胁,成为棉花生产的主要障碍,因此被称之为“棉花的癌症”。

一、棉花黄萎病的致病机理

棉花黄萎病病原菌属半知菌亚门淡色孢科轮枝菌属,主要是由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)及黑白轮枝菌(V. albo-atrumReinke& Berth)两个种致病危害,其它诸如V.nigrescens等对棉花致病力较弱。两个主要致病种在不同产棉国的分布有明显差异,大量研究证实,我国棉花黄萎病病原菌属大丽轮枝菌。黄萎病菌可侵染棉花维管束,引起系统性发病。研究者将黄萎病侵染循环划分为腐生期和寄生期。寄主致病后的症状表现多种多样,其中以维管束褐变和叶片萎蔫最为突出。早期研究认为,由于病菌在导管内定殖,促使胶状物质堵塞导管,使水分运输发生困难,从而导致棉株萎蔫。并由于水分供应短缺,而引发生理代谢连带变化,产生叶片黄化,植株矮化变形等多种症状表现。研究表明,棉花黄萎病病菌毒素(一种蛋白质脂多糖复合物)是致萎因子,强致病力菌系分泌糖蛋白含量高于弱致病力菌系;不同致病力菌系分泌的糖蛋白毒素的致萎性与病菌致病性相同;糖蛋白毒素的致萎性不仅取决于其含量,而且取决于其活性,糖基化程度可能与致病类型有关。沈其益等认为,毒素致萎作用更为重要,另有导管堵塞的致萎作用。所以,关于黄萎病菌的致病机理,目前普遍接受的观点是黄萎病菌产生一种含多糖蛋白类次生物质的萎蔫毒素,通过毒素侵染棉花、导致棉花发病,甚至杀死棉花植株。

二、放线菌的生防优势

放线菌是土壤习居菌，超强的适应能力使防效具有良好的稳定性对土传植物病害的防治有着先天性优势。放线菌在自然界的分布十分广泛，土壤中的放线菌资源最丰富，除此之外，分布在江河、海洋、沙漠、植物根际等多种自然环境中

的放线菌资源也很丰富。种类繁多、孢子抗逆性强、可产多种抗生素、菌剂保藏时间长及诱导寄主植物产生系统抗性等优点使放线菌在实际生产应用中更加简便、经济。早期由Wakksman和Umezwa率先发现放线菌具用多方面的用途，研究证明在生产中放线菌对多种土传病害起到很好的防治作用。放线菌是维生素、酶和酶抑制剂等多种活性物的生产菌，迄今为止已报道的具有生物活性的次级代谢物共有22500余种，其中具有拮抗活性的16500种，在这些拮抗物质当中有10100（45%）产自于放线菌，7630种源自于链霉菌，其余来自稀有放线菌。

三、放线菌对植物病害防治途径

放线菌通过两种途径对病害产生拮抗作用，一方面放线菌自身可在宿主植物组织内定殖诱发植物自身产生抗病性或者产生抑菌物质，从而影响病原菌的繁殖、生长，而达到防病治病的目的，早在1940年，人们发现链霉菌属能产生拮抗物质及水解酶类，而被用于防治植物病害。另一方面，拮抗放线菌对病原菌能产生抗生作用，这里的抗生作用主要是指放线菌可产生对病原菌具有抑制作用的抗生素及次级代谢产物从而达到抑菌的目的。另外，放线菌可以分泌多种胞外水解酶，放线菌种类可寄生于靶标菌菌体上，通过水解酶的作用，破坏靶标菌细胞壁及细胞膜，从而获取靶标菌细胞内部营养，致使靶标菌营养缺失而受遏制。

四、抗生素对病害具有抑制作用

放线菌是抗生素的主要生产者，抗生素（Antibiotics）是指由微生物产生的一类在较低浓度时，便对其它的微生物生长有一定抑制或杀灭作用的非酶类化学物质。放线菌生产的抗生素种类十分繁多且功能各异，其中部分活性物质在植物病害防治中起着至关重要的重要。

五、利用放线菌进行转基因育种

首先通过分离工作获得大量的放线菌的菌种资源，并通过实验室拮抗筛选实验筛选出对棉花黄萎病有明显拮抗作用的放线菌，研究所筛选的放线菌的拮抗机理，保留其中以产生抗生素达到拮抗作用的放线菌，并对其进行再次的筛选，得到拮抗效果最好的菌株，下面进行拮抗放线菌所产抗生素的种类确定工作，接着对其基因组的功能进行分析，确定产生对棉花黄萎病有拮抗作用的抗生素的控制

基因的序列，选择合适的限制性核酸内切酶，提取拮抗放线菌的总DNA，并进行PCR扩增，电泳检查并且对其进行回收，然后对回收的DNA进行酶切，获得目的基因，构建合适的载体将目的基因与质粒载体相连结，之后利用农杆菌介导法来获得自身产抗生素的转基因棉花。这样棉花可以通过自身产抗生素的途径来达到防治黄萎病的目的。

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