(3)．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于—80℃。勿反复冻融已制备好的样品。
(4)．通过超速离心清除所有的杂质。
(5)．加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。 3．细胞裂解的方法 (1)温和的裂解方法
1)渗透裂解：主要应用于血细胞、组织培养细胞；通常用低渗溶液悬浮细胞。 2)冻融裂解：常用于细菌、组织培养细胞；通常用液氮迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次。
3)去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放其内容物；常用于组织细胞；通常用含有去污剂的裂解液重悬细胞，也可以直接用样品裂解液或重泡胀溶液进行裂解。另外，如果阴离子去污剂SDS用于裂解细胞，可以用含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液稀释样品，也可以用丙酮沉淀以分离出SDS。
4)酶裂解法：某些细胞含有细胞壁，需要首先用酶来消化细胞壁。例如：用溶菌酶(1ysozyme)来消化细菌的细胞壁；用纤维素酶(cellulase)和果胶酶(pectinase)消化植物；用溶细胞酶(1yticase)消化酵母细胞壁。此法常用于植物、细菌和真菌。通常这些酶在等渗溶液中处理细胞。 (2)剧烈的蛋白裂解
1)超声裂解法：超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果，但需注意应最大可能减少热量和气泡的产生。此法常用于细胞样品。通常用迅速的超声重悬细胞，并在冰上冷却。
2)弗氏压碎器(French Pressurecell)：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。此法常用于含有细胞壁的微生物，如细菌、酵母和藻类。通常将细胞悬液置于预冷弗氏压碎器中，加压后收集粗提液。
3)研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，此法常用于固体组织、微生物。组织和细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状。可加少量石英砂研磨。
4)机械匀浆法：常用于固体组织。匀浆器可用于破碎细胞或一些软组织；而混合器或一些研磨设备用于一些较大的组织。通常将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液(3～5倍于组织体积)，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液。
5)玻璃珠匀浆法：通常剧烈振荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物。此法常用于细胞悬液或微生物。用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞(湿重)加入1~3g玻璃珠，剧烈振荡1 min，冰浴1min。重复上述步骤得到蛋白质样品。
4．用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
1)PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一种不可逆抑制剂，常用浓度为1 mmol/L，灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇(DTT)或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减少，因此，在晚些时候可加入含巯基的试剂。
2) 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸(EDTA、EGTA）：通常应用1mmol／L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。
3) 肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽(1eupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A，(pepstatin)，抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin)，抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在pH=9的时候不能抑制蛋白酶。
4) 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用浓度在0.1~0.15mmol/L，这些柑同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
5．蛋白质的分步提取技术 具体操作步聚如下：
第一步：水溶液的提取：约5~15 mg细胞加入2ml裂解液I（40mmol/L Tris）。反复冻融3~4个循环，加入适量的Dnase I和Rnase A，振荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。
第二步：含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取：向第一步的沉淀中加入500μl的裂解液II（8mol/L Urea, 4% CHAPS, 100mmol/L DTT,40 mmol/L Tris，0.5% Pharmalyte 3-10，20μg/ml Dnase I和5μg/ml RnaseA）。剧烈振荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。
第三步：含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取：将上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris清洗后，加入200μl裂解液III（5 mol/L Urea, 2mol/L thiourea, 2%SB3-10， 2mmol/L TBP, 40L Tris，0.5% Phar-malyte 3-10，20μg/ml DNase I和5μg/ml RNase A）。强裂振荡混匀，离心后收集上清，保存于-70℃。
分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液成分是40mmol/L Tris的无离子水溶液，有效溶解亲水性的蛋白质。
3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和交联剂N，N—甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene bisacry—lamide，常称甲叉双丙烯酰胺)按一定比例混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合而形成的交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应从而发生交联，形成网状结构。如图3- 所示。
图3- 聚丙烯酰胺凝胶的单体结构和网状结构
Smithies和Poulikt(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是由O’Farrell等首先于1975
年发明，其原理是根据蛋白质等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠—聚丙唏酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)(图4-2)。在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS-PAGE在20 cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cm×40cm的大胶上获得这一分离效果。利用特殊的样品制备方法可大大提高二维电泳的分辨能力。
Bio-Rad公司的PROTEAN IEF(图4-4)，其编程自动化及高至8000V或10 000V的电压使得IEF在一个晚上即可完成，大大缩短了2-DE的进程。
3.3.2.3图像分析与细胞蛋白谱的建立
二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、酸性银染、碱性银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后；通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星“状排列的小圆点，其中每一个点代表一个蛋白质。从该图谱可以初步得到该细胞内蛋白质的分布范围(偏酸性或偏碱性)、表达蛋白质的个数(凝胶点的数目)、蛋白质的大概相对分子质量、等电点（通过相对分子质量和等电点分析校正）、蛋白质相对表达丰度(点的灰度值)。需要说明的是，由于在电泳过程中涉及到亚基内或亚基间二硫键的还原和烷基化处理，亦即高级结构的去除，因此，通过二维电泳分离所得到的实质上是构成蛋白质的各个亚基，而非完整的功能蛋白质。
蛋白质组学研究工作流程
双向电泳→蛋白质染色→蛋白质图谱影像对比 →蛋白质鉴定→纲络上资料库搜寻和整理 蛋白质组分析的基本方法和技术
(一)双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DGE)蛋白质组技术的核心。 第一向：等电聚焦(Isoelectrifocusing gel electrophoresis,IEF）电泳 IEF电泳原理
蛋白质是两性物质，在不同pＨ溶液下所带净电荷不同，当其净电荷为零时的pＨ值即为该蛋白的等电点pＩ。蛋白质在具有pＨ梯度的电场中，当pＨ
由此可知，等电聚焦是利用具有不同等电点的蛋白质在线形pＨ梯度下泳动，并聚焦于其pＩ值相同的pＨ位置，达到蛋白质混合物分离的方法。
1966年瑞典学者vesterberg和Svensson合成了两性电解质，并成功地用于肌红蛋白的分离，其后瑞典LKB厂生产两性载体，商品名为Amphaline以及成套电聚焦设备 1、线形pＨ梯度的形成:
1) .载体两性电解质pＨ梯度
常用两性电解质Ampholine,是一种多氨基多羧基两性化合物的混合物。ＭＷ：300—1000Da,直流电场下，从正极→负极连续pＨ梯度，分辨率可达0.01pH单位（图示原理）
当将两性电解质Ampholine放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中就会失去质子而带负电，这样就会受附近的电极所排斥而向相反方向移动，即可形成一个由阴极向阳极逐步升高的pH梯度
2) .固相pＨ梯度
固相pＨ梯度：Immobiline由7种丙烯酰胺衍生物组成，可与丙烯酰胺和甲叉双丙烯
酰胺共同聚合，使pH梯度固定于凝胶中→Immobiline干胶条→IPG（Immobilized pH gradients）.分辨率可达0.001pH单位
2、等电聚焦的优点
有很高的分辨力：蛋白质的等电点仅相差0.02pH单位， 电聚焦的作用抵消了扩散作用，区带越走越窄。
第二向：SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)
SDS-PAGE原理
SDS与蛋白质的疏水部分结合，破坏蛋白质的折叠结构，因此，蛋白质亚基的电泳迁移取决于亚基分子量的大小，而电荷因素已被忽略，由于分子筛作用，按蛋白质分子量大小进行分离。
等电聚焦操作步骤、SDS-PAGE电泳程序将在生物化学研究法中介绍 3.3.2.1二维电泳蛋白质提取与样品制备
3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离
3.3.3.3图像分析与细胞蛋白谱的建立
3.4生物体内蛋白质的降解
3.4.1蛋白质的酶促降解
生物体内蛋白质的降解是在一系列蛋白水解酶的作用下加水使肽键断裂生成氨基酸的过程。蛋白水解酶又叫做蛋白酶，也叫肽酶。根据酶对蛋白质分子的作用部位不同，将肽酶分为肽链内切酶（endopeptidase）、肽链外切酶(exopeptidase)和二肽酶三类。如图10-1所示
图10-1蛋白水解酶作用示意图
1．肽链内切酶和外切酶
肽链内切酶可以水解蛋白质内部的一些肽键，如胰蛋白酶（trypsin）水解精氨酸、赖氨酸等残基的肽键，胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等残基组成的肽键，胃蛋白酶（pepsin）专一性水解芳香族氨基酸的氨基形成的肽键，弹性蛋白酶(elastase)的专一性差，可以水解各种脂肪族氨基酸组成的肽键。蛋白质在各种蛋白酶的作用下分解为许多小肽，暴露出许多末端，然后在肽链外切酶的作用下，进一步水解成各种氨基酸。肽链外切酶主要有氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶(aminopeptidase)作用于肽链
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