转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文(4)

第一章文献综述１９９１）啪１、转座子标签法（Ｍａｒｉｎ等１９９６）啪１、异源基因作探针筛选基因组或ｅＤＮＡ文库（Ｒｏｍｅｒ等１９９３ｍｕ，Ｍａｎｎ等１９９４嘲，Ｒｏｎｅｎ等１９９９ｍ，蝴）、图位基因克隆技术（Ｉｓａａｃｓｏｎ等２００２陟１，Ｐａｒｋ等２００２叫）及其利用可合成各种类胡萝卜素的工程大肠杆菌作为酶的底物的“颜色互补＂等技术（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等１９９６‘‘瑚１，Ｍｏｅｈｓ等２００１咖’），使得参与类胡萝卜素生物合成的基因都已从高等植物中分离出来。１．４酿酒酵母体内合成番茄红素在本身不产类胡萝卜素的微生物体内合成类胡萝卜素，这个系统需要具备以下几个条件：①要有足够的前体物质（萜类化合物）畸ｕ；②在宿主体内转入类胡萝卜素生物合成酶基因后，要保持这些酶表达的平衡性，不形成中间代谢物的大量积累，妨碍目标产物的合成；③进行合理的载体构建，以减少中间代谢物的堆积，增加目标产物的产量魄１。例如：产朊假丝酵母㈨转入ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔｌ后，合成Ｊ，番万百红素，然后冉转入全长删Ｇ基因，番茄红素产量由原来的１．１ｍｇ／ｇ（Ｄｗ）提高到２．１ｍｇ／ｇ（ＤＷ）。转化ＨＭＧ基因的催化区域（该基因的１３３９－－－一２８０５部分）比转化全长删Ｇ更有效，‘番茄红素产量达４．３ｍｇ／ｇ（Ｄｗ）。此外，引入一些其他基因，还能产生出Ｂ一胡萝卜素和虾青素等。Ｙａｍａｎｏ陆¨等将ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔｌ基因转入酿酒酵母体内，得到番茄红素１１３ｕｇ／ｇ干菌体，同时测得细胞内麦角固醇的含量为１．９６ｍｇ／ｇ干菌体，比转化前减少了１０％，麦角固醇和类胡萝卜素的分支点在香叶焦磷酸（ＦＰＰ），说明ｃｒｔＥ基因的导入，使代谢流向类胡萝卜素方向倾斜。本试验之所以最后选择酵母作为转基因宿主是因为：酵母（ｙｅａｓｔ）是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性（易培养、繁殖快、便于遗传操作等），又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酿酒酵母的工业应，●用比较广泛，历史悠久，遗传背景清楚，不产生有毒物质，生物安全性好，易于推广应用，现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型：天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究酵母本身不产类胡萝卜素，但其体内有类胡萝ｂ素前体萜类物质，如向酵母体内转入一系列类胡萝卜素合成酶基因，可在酵母体内形成类胡萝卜素合成途径。且类胡萝卜素物质不需提取，可随酵母单细胞蛋白一起食用或作饲料用。这将大大降低生产成本，并减少在利用有机溶剂提取类胡萝ｂ素过程中的产品污染，这就为酿酒酵母的番茄红素的合成奠定了基础。在本试验中，将实验室保存的由季静老师在药用草原黄花龙胆中分离出来的ｐｓｙ，ｐｄｓ、ｚ凼三个基因泓１转Ａ．至Ｕｗ３０３酿酒酵母中，从而实现转基因酿酒酵母对番茄红素的高效表达。１．５研究中的主要技术目前在番茄红素的生物合成方面应用各种分子生物技术进行基因重组操作：在产物分析检测手段上利用ＨＰＬＣ．ＭＳ等检测手段。１．６研究目标、内容及方案１．６．１研究目标①构建高产类胡萝ｂ素的酵母菌株；②摸索构建好的基因工程菌株的最适发酵条件，以期能工业应用。１．６．２研究内容①以酿酒酵母为宿主，以酵母整合型载体为表达载体，探索构建高产类胡萝ｂ素的酵母菌株‘５５１；’●②对构建好的基因工程菌株进行发酵试验，逐级扩大Ｐ摸索其发酵最佳的培养条件。第一章文献综述１．６．３实验方案以酿酒酵母为宿主，向其体内转入来自药用黄花龙胆的一系列类胡萝ｂ素生物合成酶基因，因在酿酒酵母体内异戊二烯类代谢途径只到ＧＧＰＰ为止，且酵母自身不具有合成类胡萝卜素的能力，需要转入的基因包括：八氢番茄红素合成酶基因ｐｓｙ，，八氢番茄红素脱氢酶基因ｐ出和ｚ凼等，促使其表达类胡萝卜素产物，最终获得表达番茄红素的酿酒酵母菌株。以摇瓶发酵实验为基础，确定培养条件以及最佳培养基。１４天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究第二章将目的基因转入酿酒酵母酵母（ｙｅａｓｔ）是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性（易培养、繁殖快、便于遗传操作等），又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酿酒酵母的工业应用比较广泛，历史悠久，遗传背景清楚，不产生有毒物质，生物安全性好，易于推广应用，现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型。酵母本身不产类胡萝Ｉ－素，但其体内有类胡萝卜素前体萜类物质，如向酵母体内转入一系列类胡萝卜素合成酶基因，可在酵母体内形成类胡萝Ｉ－素合成途径。且类胡萝卜素物质不需提取，可随酵母单细胞蛋白一起食用或作饲料用。这将大大降低生产成本，并减少在利用有机溶剂提取类胡萝卜素过程中的产品污染，这就为酿酒酵母的番茄红素的合成奠定了基础。在本试验中，将实验室保存的由季静老师在药用草原黄花龙胆中分离出来的ｐｓｙ、ｐｄｓ、ｚｄｓ＝一个基因转入到ｗ３０３酿酒酵母中，从而实现转基因酿酒酵母对番茄红素的高效表达。２．１实验材料２．１．１质粒、菌株与引物本实验中使用的菌株和质粒见表２．１，所用引物见表２．２。第二章将目的基因转入酿酒酵母表２－１本工作所用菌种和质粒Ｔａｂｌｅ２．１ＳｔｒａｉｎａｎｄＰｌａｓｍｉｄｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋｗ３０３（ＭＡＴａ／ＭＡＴａ｛ｌｅｕ２－３，１１２菌种ｔｒｐ！－１ｃａｎＩ一１００ｕｒａ３－１ａｄｅ２—１ｈｉｓ３—１ｌ，１５）【ｐｈｉ＋】）ＤＨ５ａｐｄｓｐｄｓ－ＵＰ一５’ｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａａｔｇｔｃｔｃａａｔｔｇｇｇａｃａｃａ３’’ｐｄｓ－ＤＮ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃｔｔｇｃｔ３‘ｚｄｓｚｄｓ—ＵＰ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｃａｔｇｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｇｃｔｔ３’．ｚｄｓ－ＤＮ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｃｔｃａｇａｃａａｃａｃｔａａａｃｔｔｃ３’ｐｓｙｐｓｙ－ＵＰ一５’ｇｃｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｔｃｔａｔｔｔｇｔａｃｇｃｔａｔ３’，．ｐｓｙ－ＤＮ－５’ｇｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｃａｔｇｔｔｔｇｇｇｇｔａｔｃａｔａ３’２．１．２实验仪器表２．３实验仪器Ｔａｂ．２—３Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ１６

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文(4)在线全文阅读。