转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文(3)

天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究１．２．３番茄红素的生物合成途径以及主要生产方法１．２．３．Ｉ番茄红素的生物合成通过生化分析、经典遗传学和近年来分子遗传学的研究，已经基本清楚类胡萝ｂ素生物合成的主要途径。所有类胡萝卜素都是通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成的。它是一类自乙酰ＣｏＡ开始的次生代谢产物，其形成过程为：３个乙酰ＣｏＡ分子通过失去１个分子的羧基而缩合成３一甲基一３，５一二甲基戊酸（ＭＶＡ），在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸（ＩＰＰ），ＩＰＰ在ＩＰＰ异构酶作用下异构为二甲基丙烯基二磷酸（ＤＭＡＰＰ），ＤＭＡＰＰ依次与３分子的ＩＰＰ在ＧＧＰＳ（ＧＧＰＰ合成酶）的作用下，缩合生成二甲基辛烯焦磷（ＧＰＰ）、法尼基二磷酸（ＦＰＰ）、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸（ＧＧＰＰ）。２个ＧＧＰＰ在八氢番茄红素合成酶（ＰＳＹ）作用下头对头进行二聚作用形成第１个无色的类胡萝ｂ素一八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成Ｑ一胡萝卜素、Ｂ一胡萝卜素，‘Ｑ、１３一胡萝卜素经引入、转化、环化、氧化等反应形成结构更复杂的虾青素、叶黄素、新黄质等乜２１。异戊烯焦磷酸（１ＰＰ）ｌＧＧＰＳ栊儿基栊牛儿基焦磷酸（ＧＧＰＰ）ｌＰＳＹ八氢番茄红素ＩＰＤＳ夭氢番茄红素ｌＰＤＳ‘．胡萝卜素ｌＺＤＳ链孢红素ｌＺＤＳ番茄红素７第一章文献综述在这里我们对本试验所要使用的三种基因及最新进展进行简要介绍ＰＳＹ（八氢番茄红素合成酶）ＰＳＹ催化ＧＧＰＰ转化成八氢番茄红素，ｎｈｐｓｙ基因编码，其ｅＤＮＡ长１．３～１．６Ｋｂ，编码４０９～４２３个氨基酸，基因全长３．２～６．０Ｋｂ，有５～７个内含子【２３１。ＰＤＳ（八氢番茄红素脱饱和酶）ＰＤＳ催化八氢番茄红素向己一胡萝卜素转化，由ｐｄｓ基因编码，其ｃＤＮＡ长１．９～２．３Ｋｂ，编码５６６－－－５８２个氨基酸。从八氢番茄红素到番茄红素一系列去饱和的过程中，细菌、真菌和植物与蓝细菌中涉及不同类型的酶。分子生物学研究表明，在八氢番茄红素到番茄红素的代谢过程中涉及一系列的去饱和酶。基本可将他们分成两种类型，Ｃｒｔ、Ｐｄｓ型。Ｃｒｔ型包括细菌和真菌的八氢番茄红素去饱和酶，羟基链孢红素去饱和酶，‘一类胡萝ｂ素去饱和酶。ｐ口ｉ：泡括植物、’蓝细菌的八氢番茄红素去饱和酶和辣椒的‘～类胡萝卜素去饱和酶。这两种酶的区别在于去饱和反应中作为受体氢的辅助因子不同，分别是ＦＡＤ和ＮＡＤＰ乜钔。‘ＺＤＳ（‘．胡萝ｂ素脱饱和酶）ＺＤＳ催化‘．胡萝‘卜素向番茄红素转化，由ｚｄｓ基因编码，?其ｃＤＮＡ长１．８～２．ＩＫｂ，编码５５８～５７４个氨基酸【２５１。１．２．３．２番茄红素的生产方法目前番茄红素的生产方法主要有天然产物制备法、化工合成法和微生物发酵法口郇。天然产物制备法包括从高等植物和藻类中提取Ｂ一胡萝卜素、番茄红素和虾青素，此法的制备技术由原料的前处理，萃取和纯化三部分组成，成本较高。化工合成法比较成熟，在１９５４年即有Ｂ一胡萝ｂ素产品问世，但多年来化工合成的类胡萝卜素一直存在着立体化学结构与天然类胡萝卜素差别较大，生物活性低，只能作为着色剂使用。随着现代发酵技术和生物反应器技术的发展，利用微生物生产类胡萝ｂ素成天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究为获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径。研究人员对利用微生物发酵生产番茄红素方面进行了大量研究，涉及微生物主要有三孢布拉氏霉菌（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）乜７１、一些基因改造的酵母菌㈨、红色细菌及能自身合成番茄红素的革兰氏阴性非光合菌，包括萎蔫欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）和草生欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ）啪１。下面分别以不同微生物的发酵生产研究进行简单概述。红色细菌的番茄红素含量较高，但未能进行工业化生产。有一则６８年专利曾报道用浅红链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）突变株发酵６ｄ产番茄红素０．５９／Ｌ。最红素。将ｐＨ控制在非生长最适宜范围（ｐＨ６～６．４）或在培养基加入高盐（８５ｍｍｏｌ／１氯化钠），番茄红素产量达７．４ｍｇ／ｇ生物量。革兰氏阴性非光合菌ｉ包括萎蔫欧文氏生物合成代谢途径的研究。之后，ＲｏｓｅＭ等利用大肠杆菌载体ｐＡ－－－－－ＣＹＣｌ８４建立携带欧文氏菌控制番茄红素合成基因的质粒ｐＡＣＣＲＴ－－ＥＩＢ（载有ｃｒｔＥ，Ｂ，Ｉ），将其转入！三孢布拉氏霉菌在工业化生产中主要用于１３一胡萝卜素的生产。当在培养过７．，的前体物质（１３一紫罗酮和异烟肼）之后选正确时机添加１３一胡萝卜素环化阻断剂，一申请，产量０．１５９／Ｌ。Ｇａｖｒｉｌｏｖ等人添加了烟草的废弃物１％于霉菌的发酵液中，经９细菌近研究者分离出一分枝杆菌属野生菌株，在其产生的类胡萝卜素中有８０９６为番茄茵和草生欧文氏菌虽然也能自身合成番茄红素，但含量较低，主要用于番茄红素．ＩＭｌ０１大肠杆菌后生产出２００，－－－５００ｕｇ／ｇ（ＤＷ）的番茄红素啪１。霉菌程中添加一些胺类和杂环氮化合物以抑制细胞内环化酶的活性时，三孢布拉氏霉菌合成大量的番茄红素。不过，这种抑制机制一直是用来研究胡萝卜素生物合成途径，用于生产则较少。王永生等在培养中添加三孢布拉氏霉菌合成１３一胡萝卜素一定程度地提高了番茄红素的产量。控制环化的另一个重要条件是ｐＨ，中性偏高有利番茄红素形成，方法是添加碳酸钠保持发酵液ｐＨ６．６以上，有关工艺已有专利１ｌＯｈ发酵，得到番茄红素约６０～８０ｍ∥ｌＯＯｍｌ［３１］ｏ非离子型表面活性剂ｓｐａｎ一２０可以第一章文献综述改变发酵液流体特性和细胞通透性，再加上其水溶性，从而有利于细胞内外物质的传递，达到有利于番茄红素合成的条件，因而可使番茄红素生产能力提高２倍，达９８．６ｍｇ／Ｌ发酵液。用三孢布拉氏霉菌发酵生产技术获得的结晶番茄红素，经异丁基醋酸盐再结晶可得到高纯度的反式番茄红素。藻类藻类中广泛地存在有类胡萝卜素，但以１３一胡萝卜素最为普遍。国内外学者们在利用藻类发酵生产类胡萝卜素的生产菌株及工艺方面进行了广泛的研究，其中杜氏藻、红球藻等在国外已被批准用于商业生产类胡萝卜素。结合三孢布拉氏霉菌研究，如若在藻类发酵过程中添加合适的阻断剂，阻断番茄红素到类胡萝卜素的环化途径，同样就可以积累大量的番茄红素。而利用藻类生产类胡萝卜素技术的相对成熟，转化率较高，这必将会大大促进微生物发酵生产番茄红素应用潜力。综上所述，利用基因工程和生物技术己能部分控制番茄红素合成过程中前体物质的转化方向，如使ＦＰＰ竞争性地从生成麦角固醇转向番茄红素。虽然采用微生物发酵生产番茄红素技术目前未能达到工业化生产的规模，但从发展趋势来看，发酵法成本及污染相对较低，如能进一步提高菌体的贮存力和转化力，是实现工业化生产番茄红素经济而有效的途径粤酵母菌酵母菌本身并不能合成番茄红素，研究者发现酵母在生长稳定期能在体内积累的大量麦角固醇，利用麦角固醇与类胡萝卜素的生物合成途径在ＦＰＰ分叉的特性，通过引入欧文氏茵ｃｒｔＥ竞争ＦＰＰ，使之部分从麦角固醇生物合成途径转向番茄红素的生物合成。１９９４年Ｓｈｉｇｅ－ｙｕｋｉＹａｍａｎｏ等人将生物合成番茄红素和Ｂ胡萝卜素的基因（ｃｒｔＥ，ｃｒｔＢ，ｃｒｔｔ，ｃｒｔＹ）及其启动子插入啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中，将该酵母菌在选择性培养基３０。Ｃ培养３ｄ。冷冻干燥离心过滤所得细胞，再加入丙酮，破碎细胞，再用丙酮萃取４次并蒸干丙酮得到番茄红素的含量为１１３蚓ｇ细胞干重ｂ引。产蛋白假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）也是工业生产上应用广泛的酵母菌，经常用于生产单细胞蛋白、谷胱甘肽及ＲＮＡ。ＹｕｔａｋａＭｉｕｒａ等将欧文氏杆１０天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究菌控制番茄红素合成的基因转入产蛋白假丝酵母中，利用被重组基因的产蛋白假丝酵母培养生产番茄红素，每１９干重产蛋白假丝酵母可得到０．７５８ｍｇ的番茄红素和０．４０７ｍｇ的八氢番茄红素㈨。１．２．３．３番茄红素的市场前景分析由于天然番茄红素生产困难，且具有较多对人体有利的生物活性，所以价格昂贵。国内市场上９０％的天然番茄红素售价为３万元／千克，国际市场上价格较国内市场稍低。我国已在新疆建成了番茄红素生产企业，从番茄中分离提取番茄红素，但其高成本和低产量并为缓解番茄红素供应紧张，价格昂贵的局面。虾青素目前主要是化工合成，由于其结构复杂，合成困难，其售价为２０００美元／千克。美国国内每年化工合成的类胡萝卜素销售额达３亿美元，如将这部分类胡萝卜素全部改为微生物发酵生产天然类胡萝卜素，那么将提高入类的健康水平，且带来巨大的经济效益口副。１．３微生物转基因生产番茄红素的热点及进展虽然目前已经探明了自然界存在６００多种类胡萝卜素，但是真正得到纯品的只有３０多种，并且大部分在生物体内是痕量存在的。所以目前类胡萝卜素合成研究的热点是：发现新的类胡萝卜素类物质合成基因并对原有的高产类胡萝卜素的生物体进行基因改造或在不产类胡萝卜素的生物体内导入类胡萝卜素合成酶基因，使其高产类胡萝卜素。目前的研究进展如下：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等首次从荚膜红细菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）中分离出类胡萝卜素生物合成酶基因。随后Ｍｉｓａｗａ等从噬夏孢欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）中也克隆到参与类胡萝卜素生物合成基因㈨。目前，已有１５０多个类胡萝卜素合成酶基因被分离，这些基因都为结构基因，共编码２０多种不同类胡萝卜素合成酶。．．这些基因不仅可用于利用异源基因来克隆与高等植物类胡萝卜素生物合成’’？、?．一?途径中的其它基因，并可通过基因操作，在不具有类胡萝Ｉ－素生物合成途径的大肠杆菌中合成这些类胡萝卜素物质。迄今，应用反向遗传学技术（Ｂｉｒｄ等

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