引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计(3)

注6：以上是Primer 5使用的基本流程。更详细的说明参照本文相关文件夹内“Primer Premier 5.0中文使用说明书”文件。

注7：部分资料中对于引物形成二级结构的预测提到了用单独的软件进行检测（如RNA Structure）。该软件可在其官网网址免费注册后下载 http://rna.urmc.rochester.edu/register.html ，也可在线使用 http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/ 。其使用说明可参照官方网站，也可参照本文相关文件夹内“RNA Structure 3.2 中文使用说明书”文件。

注8：在引物设计软件中，Oligo软件也是一款很常用的软件。其软件的使用技巧，详见本文相关文件夹内“使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物”文件。一般情况下，单独使用一个软件已足够；本文建议使用Primer搜索和筛选引物后，备选引物在Oligo中逐一分析。

注9：引物设计是一项复杂的工作，限于篇幅和时间等原因，本部分的介绍还很粗略。在本文相关文件夹内“引物设计相关论文”文件夹中有一些关于引物设计的论文（大多选取来源于CSCD等数据库的优秀期刊），是对本文内容的补充。同时，大家也可以自行下载和搜集更多的论文和资料，希望有精力的同学可以继续完善和提升本文。

五． 用NCBI Blastn程序比对引物

目的：检测设计的引物是否在其他非目的基因（模板）上存在非特异性的结合。 1. Blastn的使用

由网址 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome 进入Blastn在线程序。在Enter Query Sequence条目下输入或粘贴备选的引物序列。

在Choose Search Set条目下Database中选择搜索的数据库，一般选择Nucleotide collection数据库。其余设置为默认值。

注10：选择Nucleotide collection数据库原因在于其包括的序列完整，既包括预测序列也包括实验获得序列。同时，该数据库并未区分dna序列和mRNA序列。因此，在分析比对结果时应根据引物设计目的进行分析（扩增dna序列时，引物与mRNA的非特异性结合对扩增并无影响；反之亦然）。

Program Selection条目下可选择比对的严格程度，建议选择最低的严格程度（Somewhat similar sequences），因为在结果页面将按序列的相似性由高到低排列比对结果，如果选择高的比对标准可能导致漏掉对PCR扩增有较大影响的比对结果。

其余设置一般保持默认，在页面下部点击

按钮即开始比对。

2. 结果分析

Blastn的结果输入页面主要包括三个部分。第一部分是图形式的汇总，用于初步了解给定序列与数据库序列的匹配情况。

第二部分是列表式的描述。覆盖率即是给定序列与数据库序列形成的匹配占给定序列长度的比例。

第三部分是逐个显示详细的匹配情况。匹配率即匹配序列中匹配碱基的比例。匹配数量是指两段匹配序列能可能的匹配方式，给定序列可能与数据库序列的不同区段发生匹配，因此该数量可能大于1。Blastn进行序列比对时将自动考虑序列的方向，并同时考虑序列和互补序列，因此查看结果时可能需要查看“Strand”项，并查看“序列匹配情况”中的碱基数标号以确定两端序列匹配的方式（匹配，反向匹配，互补匹配，反向互补匹配）。

3. 将上下游引物均进行以上分析，保存错配模板信息，将上下游引物与目的物种或近亲物种中同一非目的模板存在匹配的引物对剔除，处理后如剩余引物对较多，在只存在单向引物错配的序列中灵活处理和剔除（该尺度可比设计引物时考虑“错配”时的标准适当放宽）。

注11：以上是Blastn的简单使用说明，详细介绍参考 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_NewBLAST.pdf 。

六． 备选引物的保守性检查

已设计好的备选引物应该再次对照基因的保守区域分析结果，根据其具体的保守性情况，在不影响扩增性能的情况下，选择保守性较好的引物。 七． 完整编码区的引物设计

完成一段模板的引物设计后即可以进行下一段引物的设计，直至完成全部序列的引物设计。在设计下一段引物时应注意与上一段引物扩增区域保留一段重叠序列（至少需要数十bp，条件允许时最好在100-200bp。尤其在每段引物扩增模板序列长度较长时，因为测序时的末端序列常易出现可靠性降低的情况），以便于完整序列的拼接。以PHIP基因为例，其编码区5端前200bp序列保守性较差。对于编码区两端序列保守性较差的情况，可根据该物种的基因组序列，参考其他物种的基因组序列或具有完整mRNA序列的物种，寻找基因两端UTR（非翻译区）中保守区域设计跨域起始/终止密码子的引物。如果由于模板质量原因，或是无法设计设计

跨域起始/终止密码子的引物时，也可先设计引物扩增基因的dna序列，确认起始/终止密码子附件的序列后，再设计引物扩增mRNA序列。（对于序列两端保守的基因则可以直接将第一个和最后一个引物设计在起始/终止密码子上）。建议在完成完整编码区的引物设计后再绘制一个具体的引物设计示意图（其他区域的扩增也是一样）。

注12： 在引物设计出现困难时，也可考虑进行简并引物的设计。简并引物设计的说明详见本文相关文件夹内“简并引物设计”文件内，其相关论文见“简并引物相关论文”文件夹内。简并引物设计的具体方法暂未见详细的介绍，有精力和兴趣的同学可以进行搜集和整理。

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